固液界面機能と脂質二重膜を用いた人工生体膜反応場の構築

利用固液界面功能和脂双层膜构建人工生物膜反应场

基本信息

批准号：
20H02690
负责人：
手老龍吾
金额：
$ 11.23万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H02690/
关键词：
脂質二重膜イオンチャネル原子間力顕微鏡無細胞合成

项目摘要

脂質二重膜と膜タンパク質が構成する分子集合体は、細胞膜を通しての細胞内外の情報伝達・物資輸送を担っている。本研究では、膜内分子集合体を人工脂質二重膜系と無細胞タンパク質合成系を用いて組み立て、その働く機構を明らかにすることを目的とする。hERGチャネルを対象として、支持脂質二重膜(SLB)への再構成と分子像観察、無細胞合成系での4量体形成、活性構造と薬剤応答の観察の3つの課題に取り組む。2022年度は、前年度までに見出した膜融合サイトとして働く多価不飽和脂質ドメインの膜融合速度依存性、天然物由来の脂質によるSLB形成、AFM観察の条件再検討および無細胞合成の条件検討に取り組んだ。フォスファチジルコリン(PC)、フォスファチジルエタノールアミン(PE)およびコレステロール(Chol)からなる三成分SLBにおいて多価不飽和PEが誘起する微小脂質ドメインはが、膜融合サイトとして働くことを前年度までに見出した。このドメインはイオンチャネルのAFM観察や電流計測などにおいてチャネルタンパク質を再構成する際のプロテオリポソーム(PL)の融合に必須である。この膜融合効率速度について、多価不飽和PEの不飽和度依存性をSLBへのベシクル融合速度を指標として調べた。SLBとベシクルをそれぞれ緑、赤の蛍光標識脂質でラベルし、SLBにベシクルを添加した後にSLBからの赤の蛍光強度を計測した。ベシクルの多価不飽和度が高いほど融合が速く進行し、その速度を定量的に評価することができた。人工脂質二重膜系への膜タンパク質再構成におけるボトルネックを解消するための知見としても有用である。hERGチャネルの発現は従来通りコムギ胚芽抽出物を用いた無細胞合成で行うが、4量体形成の効率を向上するために用いる脂質の種類も含めて発現と精製の条件を再度検討し直した。

由脂质双层膜和膜蛋白组成的分子组装体负责通过细胞膜在细胞内外进行信息传递和物质运输。本研究的目的是利用人工脂质双层膜系统和无细胞蛋白质合成系统组装膜内分子组装体，并阐明其工作机制。针对 hERG 通道，我们将解决三个问题：重构为支持的脂质双层 (SLB) 并观察分子图像、无细胞合成系统中四聚体的形成以及活性结构和药物反应的观察。 2022年，我们将重点研究前一年发现的作为膜融合位点的多不饱和脂质结构域的膜融合率依赖性、天然产物来源脂质的SLB形成、AFM观察条件的重新检查以及AFM观察条件的检查我致力于无细胞合成。去年，我们证明了由磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和胆固醇（Chol）组成的三元SLB中多不饱和PE诱导的微脂结构域可以作为膜融合位点。在离子通道的 AFM 观察和电流测量中重建通道蛋白时，该结构域对于脂蛋白体 (PL) 融合至关重要。以囊泡与SLB的融合率作为指标，研究膜融合效率对多不饱和PE的不饱和度的依赖性。 SLB和囊泡分别用绿色和红色荧光标记的脂质进行标记，将囊泡添加到SLB后，测量SLB的红色荧光强度。囊泡中的多不饱和度越高，融合进展越快，我们能够定量评估融合速度。这些发现对于解决膜蛋白重构为人工脂质双层膜系统的瓶颈也很有用。 hERG 通道的表达与往常一样使用小麦胚芽提取物通过无细胞合成进行，但我们重新考虑了表达和纯化条件，包括所用脂质的类型，以提高四聚体形成的效率。