Development of molecular-resolution imaging technique for proteins on a live cell surface and its application to cancer research

活细胞表面蛋白质分子分辨率成像技术的发展及其在癌症研究中的应用

基本信息

批准号：
20H00345
负责人：
福間剛士
金额：
$ 29.12万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、1-5 um程度の穴の開いた窒化シリコン膜の上に細胞を培養し、その穴を通して細胞表面を原子間力顕微鏡（AFM）により観察する技術を開発する。また、その技術を用いて、がん細胞の薬剤耐性化に関与する膜タンパク質であるMET分子の複合体形成を生細胞表面で観察し、薬剤耐性化の機序について分子レベルの知見を得る。これまでに、マイクロポーラスメンブレン（MPM）の上に細胞を培養する条件を確立し、穴を通して細胞表面を約10 nmの分解能で観察することに成功した。また、この技術を特許出願した。さらに、この技術により、化学固定前後の細胞表面構造をナノスケールで比較することで、化学固定により細胞表面のタンパク質が凝集し、表面構造が著しく変化することが明らかとなった。この成果をまとめて、論文として公表した（Commun. Biol. 2022）。応用研究として、METをノックアウトした肺がん細胞PC9/KOと、それにMETを過剰発現させたPC9/KIの表面構造を観察して比較した。しかし、PC9細胞の表面構造は比較的複雑で、ばらつきが大きく、本研究に適さないことが分かった。そこで、比較的細胞表面構造が単純なCHO細胞を用い、同様にCHO/KOおよびCHO/KI細胞を準備し、それらの構造比較に取り組んだ。しかし、これらの細胞は動きが激しく、穴のから浸潤が激しく、そのままでは詳細な構造比較が難しいことが分かった。その後、この問題は、観察前日に培養液中からFBSを除去して細胞活動を抑制することで解決できることを見出した。現在、これらの方法を用いて、２種類の細胞の表面構造の観察および比較に取り組んでいる。

在这项研究中，我们将开发一种技术，其中将细胞在硝酸硅膜上培养，孔的孔约为1-5 um，然后使用原子力显微镜（AFM）观察细胞表面。此外，使用这种技术，在活细胞的表面上观察到了与癌细胞耐药性有关的MET分子的复杂形成，即参与癌细胞耐药性的膜蛋白，并获得了有关耐药性机理的分子知识。迄今为止，已经建立了在微孔膜上培养细胞（MPM）的条件，并以大约10 nm的分辨率通过孔成功地观察了细胞表面。该技术也已获得专利。此外，通过以纳米级固定化学固定前后的细胞表面结构，已经发现化学固定会导致细胞表面上的蛋白质聚集并显着改变表面结构。该结果被编译并发表为论文（Commun。Biol。2022）。作为一项应用研究，我们观察并比较了遇到的PC9/KO的表面结构，以及遇到过表达的PC9/Ki。但是，PC9细胞的表面结构相对复杂且变化，并且被发现不适合本研究。因此，使用具有相对简单的细胞表面结构的CHO细胞，并以相同的方式制备CHO/KO和CHO/KI细胞，并且它们能够比较这些细胞的结构。但是，这些细胞迅速移动，并通过孔剧烈浸润，因此很难比较详细的结构。然后发现可以通过在观察和抑制细胞活性的前一天从培养基中去除FBS来解决这个问题。当前，这些方法用于观察和比较两种细胞的表面结构。

项目成果

期刊论文数量（45）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

金沢大学ナノ生命科学研究所

金泽大学纳米生命科学研究所

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

Development of nanoendoscopy-AFM for visualizing intracellular nanostructures of living cells

开发用于可视化活细胞细胞内纳米结构的纳米内窥镜-AFM

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
K. Miyazawa;M. Penedo;N. Okano;H. Furusho;T. Ichikawa;M. S. Alam;K. Miyata;C. Nakamura;T Fukuma
通讯作者：
T Fukuma

金沢大学ナノ生命科学研究所における活動の紹介

金泽大学纳米生命科学研究所活动介绍

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
Takumi Kotooka;Samuel Lilak;Adam Z. Stieg;James K. Gimzewski;Hirofumi Tanaka;李恒;今村薫平，田中桜平，水上雄太，原澤龍平，橋本顕一郎，栗田伸之，田中秀数，山田昌彦，藤本聡，松田祐司，E.-G. Moon，M. Konczykowski，芝内孝禎;塚本照輝，潤間中澤健太，岩田　太;新宅博文;福間剛士
通讯作者：
福間剛士

Wideband Magnetic Excitation System for Atomic Force Microscopy Cantilevers with Megahertz-Order Resonance Frequency