分解後プロテオミクス：法医学からの新規プロテオミクス

降解后蛋白质组学：来自法医学的新型蛋白质组学

• 批准号: 19K22756
• 负责人: 石井 晃
• 金额: $ 3.99万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-06-28 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K22756/
• 关键词: 法医学; 法医鑑定; 法医生化学; ペプチド分析; 質量分析; 死後診断; ミオグロビン; プロテオミクス

本研究では、生体試料における目的タンパクの定量法を開発し、次いで、実検体で切断されているペプチドフラグメントを同定し、法医診断に資するタンパク(ペプチド)マーカーの探索を行うことを目的とする。対象となるタンパクとしては、熱中症で上昇するミオグロビン、心不全で上昇するNT-proBNPが挙げられる。本年度は、昨年度に引き続き、標準尿サンプルからのミオグロビンの検出条件について検討した。法医鑑定においては、多くのサンプルが腐敗変性の影響を受けていることを考慮し、腐敗尿におけるミオグロビンの挙動を検討した。サンプルは４種類とし、新鮮尿、新鮮尿を濾過滅菌したもの、37度で１週間放置した腐敗尿、この腐敗尿を濾過滅菌したものである。タンパク沈殿により得られたミオグロビン（チューブあたり20 ng）にこれら尿サンプル40 microLを加えて溶解し、37度のドライオーブンにて１週間放置した。上記の試料40 microLに電気泳動用サンプルバッファーを13 microL添加し、95度5分間加熱変性後、電気泳動を施行し、ウェスタンブロッティングを行った。メンブレンを、1000倍希釈抗ヒトミオグロビン Ig G（ウサギ）と2000倍希釈抗ウサギ Ig Gに結合させた後、ExWestLumi plus (ATTO)で発色させ、ChemidocMPでバンドの検出を行った。すると、いずれの試料においてもミオグロビンのバンドは検出されなかった。これは、新鮮尿、腐敗尿のいずれにおいても、37度1週間放置ではミオグロビンが分解されると考えられ、その原因としては、細菌による分解というよりも、尿中のプロテアーゼなどによる分解や、尿中分子との結合が想定されるが、総合的には、尿中の分子による分解が考えやすい。

本研究的目的是开发一种定量生物样品中目标蛋白质的方法，然后识别实际样品中裂解的肽片段，并寻找有助于法医诊断的蛋白质（肽）标记。目标蛋白包括肌红蛋白（在中暑时会增加）和 NT-proBNP（在心力衰竭时会增加）。今年，继去年之后，我们对标准尿样中肌红蛋白的检测条件进行了研究。在法医检验中，考虑到许多样品受到分解的影响，我们研究了腐尿中肌红蛋白的行为。样本有四种：新鲜尿液、过滤灭菌的新鲜尿液、37度放置一周的灭菌尿液、过滤灭菌的灭菌尿液。将40微升这些尿样加入到通过蛋白质沉淀获得的肌红蛋白（每管20纳克）中，溶解，并在37度的干燥箱中放置一周。 40μL上述样品中加入13μL电泳用样品缓冲液，95度加热5分钟变性，进行电泳，进行Western blotting。将膜与1000倍稀释的抗人肌红蛋白IgG（兔）和2000倍稀释的抗兔IgG结合后，使用ExWestLumi plus（ATTO）显色，并使用ChemidocMP检测条带。在任何样品中均未检测到肌红蛋白带。这是因为，如果在37度下放置一周，新鲜尿液和陈尿液中的肌红蛋白都会被降解，其原因与其说是细菌分解，不如说是尿液中蛋白酶等分解所致。据推测，它与中间分子结合，但总体而言，它更有可能被尿液中的分子降解。