患者iPS細胞と疾患モデル動物による遺伝性難聴への内耳AAVゲノム編集治療の開発

使用患者 iPS 细胞和疾病模型动物开发内耳 AAV 基因组编辑疗法治疗遗传性听力损失

• 批准号: 21H03089
• 负责人: 池田 勝久
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H03089/
• 关键词: 遺伝性難聴; GJB2変異型難聴モデル; ゲノム編集; 遺伝子難聴; 内耳AAVゲノム; ips由来疾患モデル細胞; iPS由来疾患モデル細胞

本研究では、独自開発の改変型AAVベクターとiPS由来疾患モデル細胞（特許出願済）を用いた遺伝性難聴への内耳AAVゲノム編集技治療法の開発研究である。標的 とするのは遺伝性難聴最大の原因遺伝子GJB2(コネキシン26)の遺伝子変異であり、変異ゲノムの修復による根本的治療法を開発する。これまで分化誘導法の改良によりiPS細胞からCX26およびCX30によるギャップ結合を形成する内耳細胞シートを開発し（Human Molecular Genetics, 2021）、更なる条件検討によりギャップ結合複合体を形成する高分化型の細胞シートを作製した。また、マウス内耳ゲノム編集用AAVベクターの作製を 行い、蝸牛上皮全般に遺伝子導入が可能な内耳細胞用カプシド改変型AAVベクターを特許出願した（特願2021-198101）。同ベクターによりCRISPR/Cas技術でのゲ ノム編集用ベクターの設計を行った。これまでにガイド(g)RNA、Cas9 (CRISPR associated protein 9)、変異修復用ドナーDNA (ssODN: single-strand oligo deoxy nucleaotides)によるゲノム編集ツールおよびABE(Adenine Base Editor)を用いたゲノム編集ツールを各々設計し、独自開発のAAVに搭載した遺伝子導入用 ベクターを作製した。これらをマウス内耳へ遺伝子導入するための投与法の技術開発を行った。新規AAV開発では蝸牛支持細胞への感染特異性の高い改変型カプシドを選抜し、さらにプロモーター改良により同細胞での発現特異性を向上させた。

这项研究是利用独特开发的改良AAV载体和iPS衍生疾病模型细胞（正在申请专利），开发一种针对遗传性听力损失的内耳AAV基因组编辑技术的治疗方法。目标是GJB2（连接蛋白26）的基因突变，该基因是导致遗传性听力损失的最常见原因，并且将通过修复突变的基因组来开发基本的治疗方法。到目前为止，我们通过改进分化诱导方法，开发了与来自iPS细胞的CX26和CX30形成间隙连接的内耳细胞片层（Human Molecular Genetics，2021），并通过进一步的条件研究，我们开发了高度分化的细胞片层由 iPS 细胞形成间隙连接复合物（人类分子遗传学，2021）。此外，我们创建了用于编辑小鼠内耳基因组的AAV载体，并提交了用于内耳细胞的衣壳修饰的AAV载体的专利申请，该载体可以将基因导入整个耳蜗上皮（专利申请号：2021-198101） 。使用相同的载体，我们设计了一种使用 CRISPR/Cas 技术进行基因组编辑的载体。到目前为止，我们已经开发了使用引导（g）RNA、Cas9（CRISPR相关蛋白9）、用于突变修复的供体DNA（ssODN：单链寡脱氧核苷酸）的基因组编辑工具，以及使用ABE（腺嘌呤碱基编辑器）的基因组编辑工具）我们设计了每一个并创建了一个基因转移载体，并将其加载到我们独立开发的 AAV 上。我们开发了一种将这些基因注入小鼠内耳的技术。在开发新的AAV时，我们选择了对耳蜗支持细胞具有高感染特异性的修饰衣壳，并通过改进启动子进一步提高了在这些细胞中的表达特异性。

项目成果

Generation of two iPSC lines from siblings of a homozygous patient with hearing loss and a heterozygous carrier with normal hearing carrying p.G45E/Y136X mutation in GJB2

从患有听力损失的纯合子患者和携带 GJB2 p.G45E/Y136X 突变的听力正常的杂合子携带者的兄弟姐妹中生成两个 iPSC 系

• DOI: 10.1016/j.scr.2021.102290
• 发表时间: 2021
• 影响因子: 1.2
• 作者: Fukunaga Ichiro;Oe Yoko;Danzaki Keiko;Ohta Sayaka;Chen Cheng;Iizumi Madoka;Shiga Takahiro;Matsuoka Rina;Anzai Takashi;Hibiya;Tajima Shori;Ikeda Katsuhisa;Akamatsu Wado;Kamiya Kazusaku
• 通讯作者: Kamiya Kazusaku

Association Between Earwax-Determinant Genotypes and Acquired Middle Ear Cholesteatoma in a Japanese Population

日本人群中耳垢决定基因型与获得性中耳胆脂瘤之间的关联

• DOI: 10.1177/01945998211000374
• 发表时间: 2021
• 作者: Hara Satoshi;Kusunoki Takeshi;Nakagawa Hiroshi;Toyoda Yu;Nojiri Shuko;Kamiya Kazusaku;Furukawa Masayuki;Takata Yusuke;Okada Hiroko;Anzai Takashi;Matsumoto Fumihiko;Ikeda Katsuhisa
• 通讯作者: Ikeda Katsuhisa

Effects of Salicylate Derivatives on Localization of p.H723R Pendrin Mutant.

水杨酸酯衍生物对 p.H723R Pendrin 突变体定位的影响。

• DOI: 10.1016/j.anl.2022.03.009
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 1.7
• 作者: Murakoshi M; Koyama S; Kobayashi T; Usami S; Kamiya K; Ikeda K; Haga Y; Tsumoto K; Nakamura H; Hirasawa N; Ishihara K; Wada H.
• 通讯作者: Wada H.

Modeling Gap junction beta 2 gene-related deafness with human iPS

使用人类 iPS 模拟间隙连接 beta 2 基因相关性耳聋

• DOI: 10.1093/hmg/ddab097
• 发表时间: 2021
• 影响因子: 3.5
• 作者: Ichiro Fukunaga; Yoko Oe; Keiko Danzaki; Sayaka Ohta; Cheng Chen; Kyoko Shirai; Atsushi Kawano; Katsuhisa Ikeda; Kazusaku Kamiya
• 通讯作者: Kazusaku Kamiya

Activin/Nodal/TGF-β Pathway Inhibitor Accelerates BMP4-Induced Cochlear Gap Junction Formation During in vitro Differentiation of Embryonic Stem Cells

Activin/Nodal/TGF-β 通路抑制剂加速胚胎干细胞体外分化过程中 BMP4 诱导的耳蜗间隙连接形成

• DOI: 10.3389/fcell.2021.602197
• 发表时间: 2021
• 影响因子: 5.5
• 作者: Ichiro Fukunaga; Yoko Oe; Cheng Chen; Keiko Danzaki; Sayaka Ohta; Akito Koike; Katsuhisa Ikeda; Kazusaku Kamiya
• 通讯作者: Kazusaku Kamiya