電気信号を化学信号に変える電位依存性ホスファターゼVSPの動作機構の解明

阐明电压依赖性磷酸酶 VSP 将电信号转化为化学信号的操作机制

基本信息

批准号：
21H02444
负责人：
中川敦史
金额：
$ 11.07万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

電位依存性ホスファターゼVSPは、膜電位という電気信号を酵素活性の制御という化学信号に変える膜タンパク質であり、生物における電気信号の新たな役割を示す重要な分子である。本研究では、VSPの様々な状態の詳細な原子構造を解明し、VSPが電気信号を化学信号に変える動作機構の理解を目指すとともに、電気生理実験や蛍光アミノ酸ANAPを利用した実験により、細胞内の動きを追うことを試みた。この目的を達成するために、従来の研究で静止状態が安定化していることが知られている野生型VSPを対象として発現・精製条件の決定を進めた。様々な界面活性剤をスクリーニングした結果、動的光散乱（DLS）で単分散を示し、ゲルろ過、SDS-PAGEで結晶化に供すことのできる純度であることが確認できる試料調製条件を決定することができた。さらに、ホヤ由来VSP（Ci-VSP）について、電気生理学、蛍光測定、構造モデリングを組み合わせたアプローチにより、膜電位変化が酵素活性に与える影響について調べた。その結果、S4の最下流にある2つの疎水性残基が、電位センサードメイン（VSD）と細胞質酵素領域（CCR）のカップリングに重要な役割を果たすことを見いだした。また、Voltage Clamp Fluorometry（VCF）とジスルフィド結合実験により、S4とその隣のリンカーが1本のヘリックス（S4-linker helix）として動き、CCRのhydrophobic spinと呼ばれる領域に近づくことが示された。このhydrophobic spineは、VSPにおいて電気信号を化学信号に変換するためのハブとして機能していると考えられる。また、これまでに構造が得られているVSPと各種基質複合体の構造を基にして、PTENの基質認識機構についてのを明らかにすることを目指した分子動力学計算を進めた。

电压依赖性磷酸酶VSP是一种膜蛋白，可将称为膜电位的电信号转换为控制酶活性的化学信号，并且是一种重要的分子，在生物体中显示出电信号的新作用。在本研究中，我们的目的是阐明VSP在各种状态下的详细原子结构，并了解VSP将电信号转化为化学信号的操作机制。我们还旨在阐明VSP在各种状态下的详细原子结构，并了解VSP将电信号转化为化学信号的操作机制。我试图追踪 VSP 将电信号转化为化学信号的机制。为了实现这一目标，我们确定了野生型 VSP 的表达和纯化条件，在之前的研究中已知野生型 VSP 具有稳定的静止状态。通过筛选各种表面活性剂，我们确定了通过动态光散射 (DLS) 显示单分散性的样品制备条件，并通过凝胶过滤和 SDS-PAGE 确认了足以进行结晶的纯度。此外，我们采用电生理学、荧光测量和结构建模相结合的方法研究了膜电位变化对海鞘 VSP (Ci-VSP) 酶活性的影响。结果，他们发现S4最下游的两个疏水残基在电压传感器结构域（VSD）和细胞质酶结构域（CCR）的耦合中发挥着重要作用。此外，电压钳荧光测定 (VCF) 和二硫键实验表明，S4 及其旁边的接头以单螺旋（S4-接头螺旋）的形式移动，接近称为 CCR 疏水自旋的区域。这种疏水性脊柱被认为是 VSP 中将电信号转换为化学信号的枢纽。此外，基于迄今为止获得的VSP和各种底物复合物的结构，我们进行了分子动力学计算，旨在阐明PTEN的底物识别机制。