Development of precise genome editing technology without genetic transformation or tissue culture in conifer species.

开发精确的基因组编辑技术，无需在针叶树物种中进行遗传转化或组织培养。

基本信息

批准号：
21H02242
负责人：
七里吉彦
金额：
$ 10.98万
依托单位：
Forest Research and Management Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02242/
关键词：
ゲノム編集スギ直接導入樹木 in planta

项目摘要

我々は膜透過性ペプチド「ポリヒスチジン」を用いて、スギ細胞へゲノム編集タンパク質（以下、RNP）を導入し、標的領域の塩基配列の改変に成功している。この手法を茎頂分裂組織に適用し、遺伝子組換え・組織培養不要でゲノム編集個体を得る「in planta直接ゲノム編集法」を確立することが本課題の目的である。本年度は（1）茎頂分裂組織へのRNP導入条件の検討、（2）ゲノム編集効率を向上させる物理的・化学的処理の検討、（3）スギやカラマツのマイクロプロパゲーション方法の確立、（4）カラマツにおける組織培養系の構築について実施した。（1）茎頂分裂組織のL2層（植物体に成長する細胞層）にRNPを送達する前処理として、茎頂組織の致傷処理を検討した。スギおよびカラマツ不定胚の茎頂に一文字または十文字にメスを入れる、また不定胚を長軸方向に半分に割る半割という処理について、不定胚の生存率を調査した。一文字処理では、スギで85.7%、カラマツで88.9%の不定胚が正常に生育した。十文字処理ではスギで100%、カラマツで87.5%、そして、半割りにおいてスギでは35.7%、カラマツでは62.5%という生存率をそれぞれ示した。RNP導入時には十文字処理、または半割処理が有効と推察された。（2）ある界面活性剤を低濃度添加することで、スギ培養細胞でのゲノム編集効率の向上が確認された。（3）無菌培養スギの頂芽を断頭することで複数の茎頂組織の誘導に成功した。また、培地中に植物ホルモンを添加することで、培地設置面から茎頂組織が誘導されるのを確認した。双方とも1-2ヶ月という短期間のうちに茎頂組織が誘導される方法であり、茎頂組織の安定供給に寄与できるものと判断した。（4）カラマツにおいて、胚を露出させた未成熟種子を供試材料とすることで、高率的に未熟胚由来の培養細胞を誘導できる培養系の開発に成功した。

我们使用膜渗透肽多组氨酸将基因组编辑蛋白（RNP）引入Sugi细胞，并成功修饰了目标区域的碱基序列。该项目的目的是应用该方法拍摄顶端分生组织，建立“植物内直接基因组编辑方法”，无需基因重组或组织培养即可获得基因组编辑个体。今年，我们将（1）研究将RNP引入茎尖分生组织的条件，（2）研究物理和化学处理以提高基因组编辑效率，（3）建立雪松和落叶松的微繁殖方法，以及（4）我们构建落叶松组织培养系统。 (1)作为将RNP递送至茎尖分生组织L2层（生长成植物体的细胞层）的预处理，我们研究了茎尖组织的致死处理。我们通过将单个或十字形手术刀插入日本柳杉和落叶松体细胞胚胎的芽尖，并通过将体细胞胚胎沿长轴切成两半来研究体细胞胚胎的存活率。在单moji处理中，雪松中85.7%的体细胞胚胎正常生长，落叶松中88.9%的体细胞胚胎正常生长。在十文字处理中，雪松的存活率为100%，落叶松的存活率为87.5%，而当劈成两半时，雪松的存活率为35.7%，落叶松的存活率为62.5%。引入RNP时，推测十文字处理或减半处理是有效的。 (2)证实在培养的Sugi细胞中添加某种低浓度的表面活性剂可以提高基因组编辑效率。 (3)通过将无菌培养的日本柳杉的顶芽斩首，成功地诱导了多个芽顶端组织。我们还证实，通过向培养基中添加植物激素，可以从培养基安装表面诱导芽尖组织。两种方法均在1至2个月的短时间内诱导茎尖组织，并且被认为能够有助于茎尖组织的稳定供应。 (4) 在落叶松中，我们通过使用带有暴露胚胎的未成熟种子作为测试材料，成功地开发了一种培养系统，可以高效率诱导来自未成熟胚胎的培养细胞。