Epigenomic analysis of the induction of apoptosis

诱导细胞凋亡的表观基因组分析

• 批准号: 19K16726
• 负责人: 武石 幸容
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Fukuoka Dental College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-03-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K16726/
• 关键词: 上皮間葉転換; クロマチン動態; 口腔上皮がん; ChIP-Seq; 口腔癌; アクチン; 癌; アポトーシス; DNA損傷

上皮系細胞が間葉系細胞の性質を獲得する上皮間葉転換(EMT)はサイトカイン TGF-βによって誘導される。EMTはその性質を変化させることから細胞内で様々なイベントを起こしていると予想される。前年度は正常細胞とがん細胞をEMT誘導し、前後のヒストン修飾を比較する計画だったが手技等の問題により完了しなかった。本年度は遅れていた口腔上皮がん細胞 HSC-3のヒストン修飾(H3 K4/K9/K27)の検出し、既に解析した正常細胞 HaCaTや同じく口腔上皮がん細胞 SASとの比較からHaCaTとSAS/HSC-3間でヒストン修飾の程度が異なることがわかった。この結果からヒストン修飾によって制御されているクロマチン構造も正常細胞/がん細胞間で違いがあると考えられる。HaCaTとSAS/HSC-3間のEMT誘導前後のマーカータンパク質の発現量に違いは、このクロマチン構造変化の違いに起因して転写活性が大きく変化している可能性が高い。エンハンサーによる遺伝子の発現制御に注目し、ChIP-Seqによる網羅解析で正常細胞/がん細胞間における転写領域等の比較を目指した。そのためChIP-Seqを行う前段階であるChIP法の条件検討を行った。最終的にホルムアルデヒドで固定し、マイクロコッカスヌクレアーゼを用いてクロマチンを剪断させる方法を採用した。しかし免疫沈降(IP)による収率が低いためNGS(次世代シークエンサー)解析ができなかった。これは固定のクロスリンク反応が過剰であること、もしくはIPに用いる抗体の効率が悪いことなどの複数の要因が考えられる。現在、クロスリンクの条件やIPに用いる抗体などを検討し、IPの収率の向上を目指している。そのため当初の計画からやや遅れている。早急にChIP-Seqを行い、正常細胞/がん細胞間の比較解析でこれら細胞間のEMT誘導の違いを明らかにする。

细胞因子TGF-β诱导上皮细胞获得间质细胞的特性的上皮间质转变（EMT）。预计EMT会在细胞内部改变其性质时会引起各种事件。在上一年，该计划是诱导正常细胞和癌细胞之间的EMT，并比较之前和之后的组蛋白修饰，但由于技术和其他程序的问题，这并未完成。今年延迟的口服上皮癌细胞（H3 K4/K9/K27）中的组蛋白修饰（H3 K4/K9/K27）的检测已被延迟，并与HACAT和SAS/HSC/HSC之间的HACONE MIDIFICATION与正常的细胞HACAT和类似的口服上皮癌细胞进行了比较。从这些结果中可以认为，由组蛋白修饰控制的染色质结构在正常细胞/癌细胞之间也有所不同。 HACAT和SAS/HSC-3之间EMT诱导之前和之后标记蛋白表达水平的差异可能会导致转录活性的显着变化，这是由于这种染色质结构变化的差异。为了通过增强子调节基因表达的调节，我们旨在通过使用CHIP-SEQ进行全面分析来比较正常细胞和癌细胞之间的转录区域等。因此，检查了芯片法的条件，这是执行芯片隔离的初步步骤。最后，采用了使用甲醛和微球菌核酸酶剪切染色质的方法。但是，由于免疫沉淀（IP）引起的产量较低，NGS（下一代序列仪）分析是不可能的。这可能是由于多种因素，例如过度固定的交联反应或用于IP的抗体的效率低下。目前，我们正在考虑用于IP的交联条件和抗体，并旨在提高IP产量。结果，它落后于原始计划。紧急执行CHIP-SEQ，通过比较分析揭示了正常细胞和癌细胞之间EMT诱导的差异。