スプライシング・NMD同時制御による抗がんメカニズムの探索

通过剪接和NMD同时调控探索抗癌机制

• 批准号: 19K16724
• 负责人: 辰野 貴則
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kanazawa Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K16724/
• 关键词: スプライシング; ＮＭＤ; NMD; SRタンパク質

本研究では、NMD阻害とスプライシング阻害の相乗効果によりがん特異的にスプライシング異常を引き起こして有害なタンパク質を合成させることでがん細胞に障害を与える機構を明らかにすることを目的としている。2019年度においてはNMD抑制下でのスプライシング阻害剤処理で様々ながん細胞に与える細胞障害性がどの程度変化するかを明らかにすることを目的として研究を進めた。HeLa細胞やHCT116細胞、293細胞などの細胞株に対しスプライシング阻害剤Pladienolide B及びIsoginkgetinを単独で添加した結果、スプライシング阻害に至適な濃度では強い細胞毒性を示し、また、低濃度のスプライシング阻害剤添加時にNMDをshRNAで阻害したが有意な差は認められなかった。そのため、2020年度においてはshRNAを用いた各スプライシング因子の阻害を行ったうえでNMDを阻害することにより、NMD抑制下でのスプライシング阻害ががん細胞に与える細胞障害性を評価することにしたが、ノックダウン効率が低く、また、MTT試験法では培養期間も限られるため明確な結果は得られなかった。 そこで、ノックダウン効率改善のため自作のshRNAのみではなくsiRNAを使用して検討を行い 、さらに長期間における細胞毒性の評価を行うためコロニー形成による評価試験法を取り入れて評価を行った。2021年度においては引き続きコロニー形成による細胞障害性の評価を行った。コロニー形成試験からはHeLa細胞やA549細胞等の細胞株でSMG6とSRSF1の組み合わせでは強く、SMG6とSRSF3の組み合わせによりわずかに細胞障害性を示すことが明らかとなった。また、SMG6のノックダウンを行うタイミングをずらすことにより細胞障害性が軽減されることも明らかとなった。しかしながら、研究代表者の体調が思わしくなく本研究を中断することとなった。

这项研究旨在阐明由NMD抑制和剪接抑制的协同作用引起的癌症特异性剪接异常的机制，从而导致癌症特异性剪接异常的协同作用，从而导致有害蛋白质的效果。 2019年，进行了研究，目的是阐明在NMD抑制下剪接抑制剂治疗的程度，将细胞毒性改变对各种癌细胞。剪接抑制剂pladienolide b和isoginkgetin单独将其添加到诸如HeLa细胞，HCT116细胞和293个细胞之类的细胞系中，并在抑制剪接的最佳浓度下显示出强的细胞毒性，并且在粘液抑制剂浓度低时，在SHRNA中抑制NMD，但在低浓度下添加了显着差异。因此，在2020年，我们决定通过使用SHRNA抑制每个剪接因子在NMD抑制下剪接抑制引起的细胞毒性，但是由于敲低效率较低，并且MTT测试方法的培养持续时间受到限制，因此无法获得明确的结果。因此，为了提高敲低效率，我们使用siRNA而不是自制的shRNA进行了一项研究，此外，为了在很长一段时间内评估细胞毒性，我们采用了一种使用菌落形成的评估测试方法。在2021财年，我们继续评估菌落形成引起的细胞毒性。菌落形成测试表明，SMG6和SRSF1的组合在HELA细胞和A549细胞等细胞系中很强，并且SMG6和SRSF3的组合略有细胞毒性。还揭示了改变SMG6敲低的时机会降低细胞毒性。但是，主要研究者的健康状况不佳，本研究被暂停。