Development of ultrasensitive detection method for call membrane antigen and its application to cancer companion diagnosis

Call膜抗原超灵敏检测方法的研制及其在癌症伴随诊断中的应用

• 批准号: 21H04686
• 负责人: 片山 佳樹
• 金额: $ 25.96万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-05 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H04686/
• 关键词: コンパニオン診断; フローサイトメトリー; 蛍光分子プローブ; 酵素増感法; がん; がんコンパニオン診断; 膜抗原; ELISA; 分子プローブ; 細胞膜抗原

本研究では細胞膜抗原の高感度検出法の開発と、それを用いたがんコンパニオン診断の開発を目的としている。2022年度は、昨年度、探索したヒト直交性酵素に関し、診断法への適用における性能を評価した。見出した8種の酵素に関して、タイプの異なるヒト細胞株(JY25, HeLa, HepG2, MCF-7)を用いて、生細胞、細胞破砕液（pH 7.4あるいは4.5）で内在活性を評価した。臨床診断に汎用される酵素も同時に評価したところ、これらの汎用酵素では、用いた細胞全てで内在活性が確認されたが、見出した8種の酵素では、内在活性が認められず、ヒト直交性酵素であることが確認できた。酵素活性の評価から、何れも診断に適用可能な活性を有していることが分かった。α-ラムノシダーゼについては由来の異なる2種の酵素を取得した。活性はいずれも診断への適用の条件を満足していたが、一方は、細胞に対する非特異吸着が確認されたため、非特異吸着が見られなかったものを用いることとした。とくにすぐれた性能を有すると期待できるα-アラビノフラノシダーゼ、α-ラムノシダーゼ、β-キシロシダーゼについて基質プローブを合成して、Cell ELISAにて細胞膜抗原の検出を試みたところ、Her3、EpCAMの検出を対象とする評価で、いずれも優れた検出能を示した。しかも、従来の診断用酵素に比べ高いS/N比を示した。次に、上記の3種の新規酵素に対する蛍光基質型分子プローブを開発し、合成に成功した。いずれも、3種の酵素間での交差反応性は全くないことも評価した。EGFR、Her3、EpCAMの同時検出を試みたところ、HepG2を用いて同時検出にも成功した。現在、この3種の酵素に対して多色型、かつ反応後に細胞に集積できるCLAMP型基質の合成を実施中である。

这项研究旨在为细胞膜抗原开发一种高度敏感的检测方法，并使用它开发癌症伴侣诊断。在2022年，我们评估了去年在诊断方法中应用的人类正交酶的性能。发现的八种酶用于使用不同类型的人类细胞系（JY25，HELA，HEPG2，MCF-7）评估活细胞和细胞裂解（pH 7.4或4.5）中的内源性活性。当还同时评估了在临床诊断中广泛使用的酶时，在这些通用酶中使用的所有细胞中都证实了内在活性，但是发现的八种酶没有内在活性，证实它们是人类正交酶。酶活性的评估表明，两者都有适用于诊断的活性。对于α-rhamnosidase，获得了两种不同起源的不同酶。两种活动都符合适用于诊断的条件，但另一方面，确认对细胞的非特异性吸附，因此未观察到非特异性的吸附。将底物探针合成用于α-阿考虑到的尿尿酸盐酶，α-rham糖苷酶和β-二基糖苷酶，预计它们的性能特别出色，并且尝试使用细胞ELISA检测细胞膜抗原时，结果表现出了出色的检测能力，显示出了出色的检测能力，以评估能力进行评估量和EPCAM Hers3和EpcAM sher3和EpcAM sher3和EpCAM shs3和EpcAM shs3和EpcAM shs3和EpCAM。此外，它表现出比常规诊断酶更高的S/N比。接下来，开发了上述三种新酶的荧光底物型分子探针并成功合成。两者也被评估为三种酶之间没有交叉反应性。当尝试同时检测EGFR，HER3和EPCAM时，使用HEPG2同时检测也成功了。当前，这三种酶的夹具型底物的合成，可以在反应后积累在细胞中。

项目成果

生細胞上の複数種タンパク質の同時多色検出を可能にする糖加水分解酵素を用いた酵素増感法の開発

开发使用糖基水解酶的酶敏化方法，可同时多色检测活细胞上的多种蛋白质

• 发表时间: 2021
• 作者: 深井悠太郎;和田智也;笹川崇男;立石 宙也・金子 諒右・新居 輝樹・岸村 顕広・森 健・片山 佳樹
• 通讯作者: 立石 宙也・金子 諒右・新居 輝樹・岸村 顕広・森 健・片山 佳樹

超清潔社会で急増する慢性炎症性疾患を標的とする免疫制御システム

针对超洁净社会中迅速增加的慢性炎症性疾病的免疫控制系统

• 发表时间: 2022
• 作者: Ryoko Shimada;Miki Yoshimura;片山佳樹
• 通讯作者: 片山佳樹

細胞膜たんぱく質の同時多色検出を可能にする「ヒト細胞直交性」加水分解酵素の開拓

开发“人类细胞正交”水解酶，可同时多色检测细胞膜蛋白

• 发表时间: 2022
• 作者: 山中皓太;金子諒右;立石宙也;谷戸謙太;新居輝樹;岸村顕広;神谷典穂;竹川薫;森健;片山佳樹
• 通讯作者: 片山佳樹

A human cell orthogonal enzyme beta-D-galacturonidase for sensitive detection of antigen proteins

一种用于灵敏检测抗原蛋白的人细胞正交酶 β-D-半乳糖醛酸酶

• 发表时间: 2023
• 期刊: Analyst
• 影响因子: 4.2
• 作者: A. Koga;C. Tateishi;R. Kaneko;N. nii;A. Kishimura;T. Mori;Y. Katayama
• 通讯作者: Y. Katayama

細胞上の複数種タンパク質の同時多色蛍光検出を可能にする酵素増感法

酶敏化方法可同时对细胞上的多种蛋白质进行多色荧光检测

• 发表时间: 2021
• 作者: 立石宙也;金子諒右;織田剛史;吉田良祐;岸村顕広;森健;片山佳樹
• 通讯作者: 片山佳樹