Na輸送体を効果的に解析可能な腎尿細管3次元培養モデルによる高血圧発症機序の解明

使用可有效分析Na转运蛋白的肾小管3D培养模型阐明高血压发生的机制

• 批准号: 20K17252
• 负责人: 水口 建
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K17252/
• 关键词: 腎尿細管スフェロイド; 3次元培養; Na輸送; アミノ酸輸送; 虚血再灌流障害; 低酸素; ３次元培養; RNAシークエンス解析; 細胞極性; 腎臓発生; 高血圧; Na輸送体; 腎尿細管

これまでの研究でHK-2細胞を3次元培養することによりヒト近位尿細管の実験モデルを確立するという目標を達成することができた。その過程でHK-2細胞の3次元培養モデルでは2次元培養モデルと比較してNa輸送能が活性化していることが判り、Na/アミノ酸輸送体であるSLC6A15がその一部を担っているのではないかというヒントを得ることができた。2022年度では、この点をさらに深く調べるためにSLC6A15に対してRNA干渉の実験を開始した。その結果、2D培養したHK-2細胞に対しては良好なノックダウン効率を得ることができたが、3D培養したHK-2細胞では十分なノックダウン効率を得られないことが判った。そこで3D培養に対するRNA干渉を実施するため、トランスフェクション方法やsiRNA濃度などの条件検討に時間を要している。一方、2022年度では本実験モデルを他の研究に活かすことはできないかと考えて、虚血再灌流障害モデルとしての使用可能性について検討した。その結果、2Dならびに3D培養したHK-2細胞では、低酸素環境下で培養することによりHIF-1αの発現を免疫蛍光染色やウェスタンブロット法で確認できた。また、通常酸素環境下に戻すことにより細胞死が起きることも確認することができた。興味深いことに3D培養では2D培養と比較して虚血再灌流後の細胞死が少ない傾向が認められ、低酸素ストレスに対して防御機構が新たに存在する可能性が考えられた。

在前期的研究中，我们通过三维培养HK-2细胞，达到了建立人体近曲小管实验模型的目的。在此过程中，发现与2D培养模型相比，HK-2细胞的3D培养模型中Na转运能力被激活，并且表明Na/氨基酸转运蛋白SLC6A15在该过程中发挥了作用。我能够得到一个暗示，情况可能是这样。 2022年，我们开始对SLC6A15进行RNA干扰实验，以更深入地研究这一点。结果，我们能够对2D培养的HK-2细胞获得良好的敲低效率，但发现对3D培养的HK-2细胞无法获得足够的敲低效率。因此，为了对3D培养物进行RNA干扰，需要时间考虑转染方法和siRNA浓度等条件。另一方面，在2022财年，我们考虑了该实验模型是否可以用于其他研究，并检验了其作为缺血再灌注损伤模型的潜力。结果，在2D和3D培养的HK-2细胞中，在缺氧环境中培养时，可以通过免疫荧光染色和Western blotting证实HIF-1α的表达。还证实，当细胞返回到正常的氧气环境时，会发生细胞死亡。有趣的是，与 2D 培养物相比，3D 培养物在缺血再灌注后的细胞死亡往往较少，这表明可能存在针对缺氧应激的新防御机制。

项目成果

Three-dimensional spheroid culture induces apical-basal polarity and the original characteristics of immortalized human renal proximal tubule epithelial cells

三维球体培养诱导永生化人肾近曲小管上皮细胞顶底极性及原始特征

• DOI: 10.1016/j.yexcr.2021.112630
• 发表时间: 2021
• 影响因子: 3.7
• 作者: Mizuguchi Ken;Aoki Hiromasa;Aoyama Mineyoshi;Kawaguchi Yohei;Waguri;Ohte Nobuyuki;Asai Kiyofumi
• 通讯作者: Asai Kiyofumi