産業廃棄物を原料としたグリコール酸高分率コポリマー創製のための代謝工学戦略

从工业废物中制造高馏分乙醇酸共聚物的代谢工程策略

基本信息

批准号：
21H03639
负责人：
山田美和
金额：
$ 10.98万
依托单位：
Iwate University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

エチレングリコールを原料としたグリコール酸(GA)高分率ポリマーの微生物合成系を目指して、本年度は下記3点の成果を得ることができた。[1] GA合成酵素(FucO, AldA)高活性変異体の作成：大腸菌由来ラクトアルデヒドレダクターゼ (FucO)とラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ (AldA)へのランダム変異導入や酵素の立体構造情報を基としたRational designによる変異導入を試み、高活性変異体の取得を目指した結果、Rational designによる変異体作成では、高活性変異体を得ることはできなかった。しかし、ランダム変異導入を試みた結果、GA合成量が従来の1.3倍向上するFucO変異体を見出すことに成功した。[2] 複数の大腸菌のミニスケールにおける同時形質転換法の基盤構築：本研究では、大腸菌のKeioコレクションを用いて、GA輸送に関わる遺伝子の特定を行うことを計画しているがそのためには、複数の大腸菌株にfucOとaldA遺伝子を導入し、同時に形質転換する必要がある。本年度は、96ウェルプレートを用いた同時形質転換法を考案し、形質転換可能な条件を見出したが、形質転換効率が低いという課題が残った。[3] GAポリマー中のGA分率が向上する培養条件等の検討：これまでの研究において、組換え大腸菌における基本的なGAポリマー合成経路を構築することができたがGA分率が非常に低かった。そこで、今年度は宿主となる大腸菌の種類やGA合成用、ポリマー合成用遺伝子を搭載するプラスミドコンストラクト、培養時間等検討を行ったが、これまで以上にGA分率が向上したGAポリマー合成条件は確認されなかった。

为了创建由乙二醇制成的高组分乙醇酸（GA）聚合物的微生物合成系统，我们今年能够实现以下三个结果。 [1] Creation of a highly active mutant GA synthase (FucO, AldA): We attempted random mutation introduction into lactaldehyde reductase (FucO) and lactaldehyde dehydrogenase (AldA) derived from Escherichia coli, and mutation introduction using Rational design based on the 3D structure information of the enzyme, and as a result, we were able to obtain a highly active mutant, and we were使用理性设计创建突变体时，无法获得高度活跃的突变体。但是，由于试图引入随机诱变，我们成功地发现了一个FUCO突变体，该突变体将GA合成量提高了1.3倍，其1.3倍。 [2]在大肠杆菌的迷你级别上建立同时转化方法的基础：在这项研究中，我们计划使用大肠杆菌的Keio集合来识别涉及GA传输的基因，但是为了做到这一点，有必要将FUCO和ALDA基因引入多个大肠杆菌株并同时转化它们。今年，我们使用96孔板设计了一种同时转换方法，并发现了转换的条件，但是问题仍然是转化效率很低。 [3]研究改善GA聚合物中GA分数的培养条件的研究：以前的研究能够在重组大肠杆菌中构建基本的GA聚合物合成途径，但GA级分很低。因此，今年我们研究了宿主大肠杆菌的类型，带有GA合成基因的质粒构建体，聚合物合成和培养时间，但没有比以往任何时候都确认具有改善GA分数的GA聚合物的合成条件。