光駆動型イオンポンプの分子動画解析とその応用

光驱动离子泵分子视频分析及其应用

基本信息

批准号：
21H02439
负责人：
南後恵理子
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02439/
关键词：
微生物型ロドプシン X線自由電子レーザーロドプシン

项目摘要

微生物由来のレチナールタンパク質（ロドプシン）は、光を受容して機能を発揮する膜タンパク質であり、最近ではその光応答性を利用して細胞の光制御を可能とするオプトジェネティクスに利用されるなど応用面でも注目されている。ロドプシンの最も代表的な機能は、イオンを能動輸送する機能であり、プロトンポンプのバクテリオロドプシン、クロライドイオンを輸送するハロロドプシン、ナトリウムポンプのKR2などが知られている。これらのイオンポンプ機能を持つロドプシンを比較すると、その基本構造は類似しており、構造の類似性にも関わらず電荷の異なるイオンを同一方向に輸送する仕組みに興味が持たれている。今までに、様々なイオンポンプロドプシンが発見されており、それらのロドプシンにおいて、部位特異的変異導入及びその活性測定やクライオトラップ法による中間体X線結晶構造解析などが行われてきたが、イオンの選択性やイオン輸送機構の全容は明らかではない。本課題では、光反応の過程をリアルタイム且つ原子レベルで可視化することを目指して、X線自由電子レーザー（XFEL）を用いた時分割実験を実施する。高い空間分解能の動的構造情報を得るには、XFELによるシリアルフェムト秒結晶構造解析が用いられており、微結晶を調製する必要がある。昨年度までに得られた微生物由来のイオンポンプロドプシンの発現系を用いて、大量発現並びに精製を行った。続いて結晶化スクリーニングを行ったところ、4Åのデータではあったが回折像を取得した。現在、高分解能の回折データを得るべく検討を行っている。

微生物衍生的视网膜蛋白（Rhodopsin）是膜蛋白，可接受光并发挥其功能，并最近用于光遗传学，它可以通过利用其光响应性来对细胞进行光控制，并在应用方面引起了注意。视紫红质的最具代表性功能是主动转运离子的功能，如质子泵中的细菌紫红素，氯离子中的卤代汀和钠泵中的KR2。当将这些视紫红蛋白与离子泵送功能进行比较时，基本结构相似，并且对尽管结构相似，但具有不同电荷离子在相同方向上运输的机制引起了兴趣。到目前为止，已经发现了各种离子泵的视紫红蛋白，并且使用冻结方法进行了定向的诱变，其活性测量以及中间X射线晶体结构分析，但使用了冻结方法，但是离子选择性的全部程度和离子传输机制的全部程度尚不清楚。在此主题中，进行了使用X射线游离电子激光器（XFEL）的时间划分实验，目的是实时和在原子水平上可视化光反应过程。为了获得高空间分辨率的动态结构信息，使用使用XFEL的串行飞秒结构分析，需要制备微晶。使用从去年获得的微生物产生的离子泵红紫红质的表达系统进行了大量的表达和纯化。随后，进行了结晶屏幕，并获得了衍射图像，尽管数据为4Å。目前，我们正在进行研究以获得高分辨率衍射数据。