Exploring new functions of DNA polymerase zeta using plant-cell systems

利用植物细胞系统探索 DNA 聚合酶 zeta 的新功能

基本信息

批准号：
20K12174
负责人：
坂本綾子
金额：
$ 2.83万
依托单位：
National Institutes for Quantum Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

DNAポリメラーゼζ(Polζ)を欠損したシロイヌナズナの変異体(rev3-1)は放射線に対して感受性を示すことから、植物のPolζがDNA二重鎖切断修復に関与していることが示唆されているが、その証拠は得られていない。本研究ではシロイヌナズナおよびヒメツリガネゴケを材料に用いてPolζの新規機能の探索を行うことを目的としている。R4年度は、ヒメツリガネゴケのDNA二重鎖切断修復に関わる経路の解析と、シロイヌナズナPolζの小サブユニットであるREV7とGFPとの融合タンパク質を発現する形質転換植物の作成を行った。1) ヒメツリガネゴケでは相同組換えに必須なRAD51Bを欠損すると放射線抵抗性が大きく下がることがわかっている。今回、RAD51Bに加えオルタナティブエンドジョイニング(alt-EJ)に関わるPOLQを欠損させた二重変異体のガンマ線に対する感受性を解析したところ、RAD51B単独変異よりもさらに放射線抵抗性が低下することがわかった。2) APRT遺伝子座をマーカーとして用いた変異スペクトル解析では、RAD51Bを欠損すると繰り返しを含む欠失・挿入変異が多く検出されている。今回、RAD51BとPOLQの二重欠損変異体の変異スペクトルを解析したところ、通常のPCRでは捕捉できない大きな構造変化が頻繁に生じることがわかった。このことから、ヒメツリガネゴケのDNA二本鎖切断修復では相同組換えに次いでalt-EJが重要なことが示唆された。3) Polζの新規機能を解明する目的でPolζの小サブユニットであるREV7とGFPとの融合タンパク質を発現するコンストラクトをREV7欠損株に導入し、rev7バックグラウンドの指標であるマイトマイシンC感受性が相補されることを確認した。また、蛍光顕微鏡による観察でGFP融合タンパク質がシロイヌナズナ細胞の核及び細胞質で発現することを確認した。

缺乏 DNA 聚合酶 z (Pol z) 的拟南芥突变体 (rev3-1) 对辐射敏感，表明植物 Pol z 参与 DNA 双链断裂修复，但尚未获得此类证据。本研究的目的是以拟南芥和立碗藓为材料，探索Polze的新功能。在 R4 年，我们分析了苔藓拟南芥中涉及 DNA 双链断裂修复的途径，并创建了表达 REV7（拟南芥 Pol z 的一个小亚基）和 GFP 之间的融合蛋白的转基因植物。 1) 在苔藓植物 Physcomitrella fasciatus 中，发现同源重组所必需的 RAD51B 的缺失会显着降低放射抗性。这次，我们分析了缺乏 RAD51B 和 POLQ 的双突变体对伽马射线的敏感性，该双突变体参与选择性末端连接（alt-EJ），发现它的放射抗性比单个 RAD51B 突变体还要低。 2)使用APRT位点作为标记的突变谱分析检测到许多删除/插入突变，包括RAD51B删除时的重复。这次，我们分析了RAD51B和POLQ双缺失突变体的突变谱，发现经常发生常规PCR无法捕获的大结构变化。这些结果表明，在立碗藓中，alt-EJ 在 DNA 双链断裂修复中仅次于同源重组。 3）为了阐明Pol z的新功能，我们将表达Pol z的小亚基REV7和GFP之间的融合蛋白的构建体引入REV7缺陷菌株中，并发现丝裂霉素C敏感性（rev7的一个指标）经核实，背景已得到补充。此外，使用荧光显微镜观察证实GFP融合蛋白在拟南芥细胞的细胞核和细胞质中表达。