Does GPI-anchored modification promote the pathogenicity and transmissibility of alpha-synucleinopathies?

GPI 锚定修饰是否会促进 α-突触核蛋白病的致病性和传播性？

• 批准号: 20K21579
• 负责人: 新 竜一郎
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: University of Miyazaki
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-07-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K21579/
• 关键词: アルファシヌクレイン; GPIアンカー; レビー小体病; 多系統萎縮症; αシヌクレイン; プリオンタンパク質; タウ蛋白; TDP-43; プリオン

プリオン病以外のタンパク質異常凝集性神経変性疾患（アルツハイマー病、レビー小体病、タウオパチー等）の伝達性や病原性はプリオン病と比較すると相対的に低く、そのメカニズムに質的な違いがあることが想定される。その要因としてプリオンタンパク質（PrP）のC末端に翻訳後修飾として付加されるGPIアンカーの存在が考えられる。本研究ではレビー小体病の病原タンパク質アルファシヌクレイン（Asyn）にGPIアンカーを付加して発現するように 遺伝子操作し、その凝集様式・疾患伝達性と神経変性のメカニズムを解明することを目的としている。まず、GPIアンカー付加シグナルペプチドをAsynのN末とC末に導入し、それぞれのタンパク質へのGPIアンカー修飾型を構築した。GPIアンカー付加シグナルペプチドとしてはPrPのものを使用した。構築した発現ベクターを培養細胞（N2a）に一過性に導入し、Asynの発現をウェスタンブロットにより確認したところ、GPIアンカーが導入されたことを反映し、GPIアンカーのない通常のAsynより分子量は上昇していた。次に、恒常的発現細胞を得るため、トランスポゾンのPiggyBac systemを用いて薬剤セレクションを行ったが、高発現細胞を得ることはできなかった。しかし、遺伝子レベルの導入はPCRで確認していたため、プロテアソーム抑制剤を投与したところ、発現の上昇を認めたことから、GPI（＋）Asynがプロテアソームでの分解が上昇している可能性が示された。一方、N2a細胞にAsynを恒常的に発現する細胞を得ることができたため、それらにレビー小体病や多系統萎縮症の脳ホモジネートを添加してプリオンのようなＡｓｙｎ凝集体の”感染“細胞が得られるかどうか現在検証している。

与prion病相比，蛋白质异常（阿尔茨海默氏病，路易氏疾病，陶氏病等）以外的蛋白质异常的传播和致病性相对较低，并且假定其机制存在定性差异。这很可能是GPI锚的存在，该锚位添加到Prion蛋白（PRP）的C端作为翻译后修饰。这项研究旨在通过将GPI锚定在病原蛋白α-肾核蛋白（ASYN）（一种Lewy体内疾病）中添加GPI锚固剂来阐明神经退行性的聚集，疾病传播和机制的机制。首先，将GPI锚添加信号肽引入ASYN的N和C端子中，并将GPI锚定修饰形式构建为每种蛋白质。 GPI锚添加信号肽是PRP。将构造的表达载体瞬时引入培养细胞（N2A），并通过蛋白质印迹证实ASYN的表达。它反映了GPI锚的引入，与没有GPI锚的正常Asyn相比，分子量增加了。接下来，使用转座子的Piggybac系统进行药物选择，以获得组成型表达细胞，但未获得高表达细胞。但是，由于PCR证实了基因水平的引入，因此当蛋白酶体抑制剂被施用时，观察到表达增加，表明蛋白酶体中GPI（+）asyn降解可能会增加。另一方面，由于在N2A细胞中获得了组成型表达ASYN的细胞，因此我们目前正在验证是否可以将脑匀浆和多个系统萎缩添加到它们中，以获得ASYN聚集的“感染”诸如prions的“感染”细胞。