疲弊化Ｔ細胞のシングルセルオミックス解析とリプグラミングによるＴ細胞疲弊の克服

通过对耗尽的 T 细胞进行单细胞组学分析和 lipgramming 克服 T 细胞耗尽

• 批准号: 20K21548
• 负责人: 西澤 正俊
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-07-30 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K21548/
• 关键词: がん免疫細胞療法; TCR-T療法; Platinum TALEN; 遺伝子改変T細胞; がん免疫療法; がん特異的T細胞レセプター導入T細胞; リプログラミング; シングルセル解析; ゲノム網羅的遺伝子解析

2020年度はまずT細胞のセルラインならびに、プライマリーＴ細胞を用いて、電気穿孔法を用いて遺伝子導入、また任意の部位を人工ヌクレアーゼであるTALENを用いて切断する実験系を構築した。複数遺伝子の改変・導入にむけ、複数の遺伝子を1回の遺伝子導入にて改変する技術、またシークエンシャルに2回にわけて遺伝子導入を行う方法を確立した。これらの技術の確立よりプライマリーT細胞の複数遺伝子を改変することが可能となり、非常に大きな技術面での進歩であった。2021年度は、その技術の臨床応用に向け、① 実際に治療用細胞をラージスケールにて作成する技術の確立、並びに②理論的に生じうるTALENによる遺伝子変異が生じないことを確認する実験系の確立、を目指した。前者①に関しては、試薬や遺伝子導入法（電気穿孔法）の条件検討を行い、プライマリーT細胞から実際の患者の治療に必要な細胞数の治療用T細胞製剤を作成する技術を確立できた。後者②であるが、実際の患者に投与するには、投与した治療用の細胞製剤が安全であることが必須であり、患者に投与する前に前臨床検査としての遺伝子変異検査が必要となる。遺伝子変異には、大きく塩基置換やInsertion-Deletionなどの配列変異と染色体構造変異（染色体転座や逆位など）があり、それぞれ別の検出系が必要となるため、それぞれの遺伝子変異検出系の確立を目指した。遺伝子配列変異に関しては、次世代シーケンサを用いてシングルセルレベルで検出する実験系を確立した。また染色体の構造変異に関しては、デジタルPCRを用いて10^-4オーダにて検出する実験系を確立することが可能となった。これらにより、我々の確立したがん治療用T細胞製剤の臨床応用に必要な細胞製剤の作成技術並びに安全管理上の必須な技術を確立し、実臨床への導入に大きく近づく成果が得られた。

2020年，我们首先使用T细胞系和原代T细胞构建了一个实验系统，通过电穿孔引入基因并使用人工核酸酶TALEN切割任意位点。针对多个基因的修饰和导入，我们建立了一种在一次基因转移中修饰多个基因的技术，以及一种分两步进行连续基因转移的方法。这些技术的建立使得修改原代T细胞中的多个基因成为可能，这是一个巨大的技术进步。在2021财年，我们将通过以下方式致力于该技术的临床应用：(1)建立一种能够实际大规模制造治疗细胞的技术，以及(2)开发一个实验系统以确认不会发生由TALEN引起的基因突变，这在理论上是可能发生的。对于前者（1），我们研究了试剂条件和基因转移方法（电穿孔），并能够建立一种技术，可以根据实际患者治疗所需的细胞数量，从原代 T 细胞制备治疗性 T 细胞制剂。对于后者(2)，为了将其施用给实际患者，所施用的治疗性细胞制剂的安全性至关重要，并且在将其施用给患者之前需要进行基因突变测试作为临床前测试。基因突变广泛地包括序列突变，例如碱基替换和插入缺失，以及染色体结构突变（染色体易位、倒位等），并且我们的目标是针对每种突变建立单独的检测系统。关于基因序列变异，我们建立了一个实验系统，使用下一代测序仪在单细胞水平上检测它们。此外，对于染色体的结构变异，可以建立使用数字PCR检测10^-4量级的实验系统。通过这些努力，我们已经建立了将我们开发的用于癌症治疗的T细胞制剂临床应用所需的细胞制备技术以及安全管理所需的技术，并取得了使我们更接近于引进该技术的成果。进入实际临床实践。

项目成果

高度な遺伝子工学技術を用いた高活性かつ安全な癌治療用TCRーT細胞製剤の開発

利用先进的基因工程技术开发高活性、安全的TCR-T细胞制剂用于癌症治疗

• 发表时间: 2020
• 期刊: Precision Medicine
• 作者: 西澤 正俊;川瀬 孝和;本庶 仁子;鈴木 隆二;一戸 辰夫
• 通讯作者: 一戸 辰夫

ゲノム編集を用いたがん免疫細胞治療の臨床開発

使用基因组编辑进行癌症免疫细胞疗法的临床开发

• 发表时间: 2020
• 期刊: 医学のあゆみ
• 作者: 一戸辰夫;川瀬孝和; 西澤正俊
• 通讯作者: 西澤正俊