疲弊化Ｔ細胞のシングルセルオミックス解析とリプグラミングによるＴ細胞疲弊の克服

通过对耗尽的 T 细胞进行单细胞组学分析和 lipgramming 克服 T 细胞耗尽

基本信息

批准号：
20K21548
负责人：
西澤正俊
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-07-30 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

2020年度はまずT細胞のセルラインならびに、プライマリーＴ細胞を用いて、電気穿孔法を用いて遺伝子導入、また任意の部位を人工ヌクレアーゼであるTALENを用いて切断する実験系を構築した。複数遺伝子の改変・導入にむけ、複数の遺伝子を1回の遺伝子導入にて改変する技術、またシークエンシャルに2回にわけて遺伝子導入を行う方法を確立した。これらの技術の確立よりプライマリーT細胞の複数遺伝子を改変することが可能となり、非常に大きな技術面での進歩であった。2021年度は、その技術の臨床応用に向け、① 実際に治療用細胞をラージスケールにて作成する技術の確立、並びに②理論的に生じうるTALENによる遺伝子変異が生じないことを確認する実験系の確立、を目指した。前者①に関しては、試薬や遺伝子導入法（電気穿孔法）の条件検討を行い、プライマリーT細胞から実際の患者の治療に必要な細胞数の治療用T細胞製剤を作成する技術を確立できた。後者②であるが、実際の患者に投与するには、投与した治療用の細胞製剤が安全であることが必須であり、患者に投与する前に前臨床検査としての遺伝子変異検査が必要となる。遺伝子変異には、大きく塩基置換やInsertion-Deletionなどの配列変異と染色体構造変異（染色体転座や逆位など）があり、それぞれ別の検出系が必要となるため、それぞれの遺伝子変異検出系の確立を目指した。遺伝子配列変異に関しては、次世代シーケンサを用いてシングルセルレベルで検出する実験系を確立した。また染色体の構造変異に関しては、デジタルPCRを用いて10^-4オーダにて検出する実験系を確立することが可能となった。これらにより、我々の確立したがん治療用T細胞製剤の臨床応用に必要な細胞製剤の作成技術並びに安全管理上の必須な技術を確立し、実臨床への導入に大きく近づく成果が得られた。

在2020财年，我们首先构建了一个实验系统，其中使用T细胞系和原代T细胞使用电穿孔进行基因转移，并使用人工核酸酶Talen裂解可选位点。为了修改和引入多个基因，我们建立了一项技术来修改一个基因转移中的多个基因，以及一种以两个序列转染基因的方法。这些技术的建立使能够修改原代T细胞中的多个基因，这是一项巨大的技术进步。在2021财年，目的是1）建立一项技术以大规模创建治疗细胞，以及2）建立一个实验系统，该系统证实不会发生由Talen引起的理论基因突变。关于前者1，我们已经能够研究试剂和基因转移（电穿孔）的条件，并建立了一种技术，以创建T细胞制备的技术，以用于从原代T细胞实际治疗患者所需的细胞数量。在后一种情况下，为了对实际患者进行管理，必须进行治疗的细胞准备工作是安全的，并且在给患者进行治疗之前，需要将基因突变测试作为临床前测试。基因突变包括大量的序列突变，例如碱基取代以及插入缺失和染色体结构突变（染色体易位和反转等），并且每个序列都需要不同的检测系统，因此我们旨在建立一个用于检测每个基因突变的系统。关于基因序列突变，建立了一个实验系统，用于使用下一代测序仪在单细胞水平上检测。此外，使用数字PCR建立一个实验系统，用于以10^-4的顺序检测染色体结构突变。通过建立用于创建用于癌症治疗的T细胞制备所需的细胞制剂的技术来实现这些结果，以及用于安全管理的基本技术，这些技术已经在实现了实际临床实践中的引入更加接近。