FRETに基づくトシリズマブの新規HPLC法の開発と薬物相互作用解明への応用

基于FRET的托珠单抗高效液相色谱新方法的开发及其在药物相互作用阐明中的应用

• 批准号: 20K16530
• 负责人: 高田 誠
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokyo University of Science, Yamaguchi
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K16530/
• 关键词: トシリズマブ; 抗体医薬品; 選択的沈殿法; HPLC; 自然蛍光検出; COVID-19; 蛍光検出; FRET; 薬物相互作用解明; サイトカインストーム

モノクローナル抗体を主成分とした抗体医薬品は世界的に高い売り上げ医薬品であり、バイオシミラーも次々に開発され、今後も臨床現場における利用が増えると予想される。それに伴い、抗体医薬品の薬理効果の確認を目的とした血中薬物濃度測定についても必要性が高まっている。現在、抗体医薬品の測定には選択性の高いELISAなどの酵素免疫測定法や酵素消化を伴うLC-MS/MS法が用いられている。しかしこれらの方法は、前処理操作が煩雑で分析完了までに時間がかかるといった問題点を有している。これらの理由から、直接血中濃度を測定することはほとんど行われていない。そこで私は、抗原－抗体反応を用いない物理化学的手法によりヒト化抗体医薬品であるトシリズマブ（TCZ）とサブクラスのIgG1を分離する前処理法の開発を進めてきた。その結果、塩基性試薬を含むアセトニトリル溶液とトリフルオロ酢酸水溶液を組み合わせることでIgG1を選択的に除去し TCZ を回収できる画期的な選択的沈殿法を見出した。さらに、ヒト血清中の TCZ を選択的沈殿法による前処理後に HPLC を用いてTCZの自然蛍光を検出することで極めて迅速かつ簡便に定量する分析法を開発した。TCZは関節リウマチなどの慢性疾患の治療のみならず、近年ではCOVID-19によるサイトカインストームの治療にも適用が拡大され、急性期治療時の効果確認の必要性が増加している。本法は慢性疾患の治療効果を確認するための感度としては不十分であったものの、これまで報告されているいずれの分析法と比較しても迅速性の面で極めて優れていることから、緊急性の高い場面における治療効果確認においては有用な手法となる。また、選択的沈殿法は物理化学的な前処理法であることから、ELISAのように抗体医薬品ごとに前処理を変更する必要性がなく、汎用性の面でも優れた手法である。

以单克隆抗体为主要成分的抗体药物是全球热销药物，生物类似药也不断被开发出来，未来其在临床上的使用预计会增加。与此同时，为了确认抗体药物的药理作用，越来越需要测量血液药物浓度。目前，高选择性酶免疫分析方法（例如涉及酶消化的 ELISA 和 LC-MS/MS 方法）用于测量抗体药物。但这些方法都存在预处理操作复杂且需要时间才能完成分析的问题。由于这些原因，很少进行血液浓度的直接测量。因此，我一直在开发一种预处理方法，使用不使用抗原抗体反应的物理化学方法将人源化抗体药物托珠单抗（TCZ）与IgG1亚类分离。结果，他们发现了一种创新的选择性沉淀方法，通过将含有碱性试剂的乙腈溶液与三氟乙酸水溶液混合，可以选择性去除 IgG1 并回收 TCZ。此外，我们开发了一种极其快速、简单的分析方法，通过选择性沉淀法预处理后，使用 HPLC 检测 TCZ 的天然荧光，定量人血清中的 TCZ。 TCZ不仅用于治疗类风湿性关节炎等慢性疾病，近年来其应用范围已扩大到包括治疗COVID-19引起的细胞因子风暴，增加了在急性期治疗期间确认其有效性的需要。尽管该方法的灵敏度不足以确认慢性疾病的治疗效果，但与迄今为止报道的任何分析方法相比，它的速度非常快，这是在高度紧急情况下确认治疗效果的有用方法。此外，由于选择性沉淀法是一种物理化学预处理方法，与ELISA不同，无需改变每种抗体药物的预处理，使其成为通用性极佳的方法。

项目成果

選択的沈殿法によるヒト血清中トシリズマブの極めて迅速かつ簡便なHPLC分析法の開発

使用选择性沉淀法开发人血清中托珠单抗的极其快速且简单的 HPLC 分析方法

• 发表时间: 2022
• 作者: 〇高田 誠;内藤和哉;渡邊一華;武藤純平;大庭義史;椛島 力;和田光弘
• 通讯作者: 和田光弘

Extremely Simple and Rapid HPLC Analysis of Tocilizumab in Human Serum with Selective Precipitation Using Alkylamine

使用烷基胺选择性沉淀对人血清中托珠单抗进行极其简单快速的 HPLC 分析

• DOI: 10.1248/cpb.c22-00475
• 发表时间: 2023
• 期刊: Chemical and Pharmaceutical Bulletin
• 影响因子: 1.7
• 作者: Takada Makoto;Watanabe Ichika;Naito Kazuya;Mutoh Junpei;Ohba Yoshihito;Kabashima Tsutomu;Wada Mitsuhiro
• 通讯作者: Wada Mitsuhiro

選択的沈殿法によるヒト血清中インフリキシマブの迅速・簡便なHPLC分析法の開発

采用选择性沉淀法开发人血清中英夫利昔单抗快速、简单的 HPLC 分析方法

• 发表时间: 2023
• 作者: 〇渡邊一華;高田 誠;武藤 純平;大庭義史;椛島 力;和田光弘
• 通讯作者: 和田光弘