視床下部神経系の軸索誘導・伸長機序の解明：マウスES細胞器官誘導系における検討

阐明下丘脑神经系统轴突引导和伸长机制：小鼠ES细胞器官引导系统研究

基本信息

批准号：
20K15917
负责人：
河田美穂
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者らはマウス ES 細胞から分化誘導した視床下部ニューロンを成体マウス視床下部内に移植すると移植細胞軸索が下垂体後葉まで投射することを明らかにした。先行研究により、反発性ガイダンス因子や細胞接着分子が視床下部の軸索伸長に関与する可能性が示唆されているが、視床下部-下垂体系の軸索ガイダンス機構の詳細は未だ不明な点が多い。そこで本年度は (1) 上記分子群の視床下部-下垂体系における発現を検討した。また、(2) 新規の軸索伸長関連因子を探索する目的で、視床下部室傍核 (PVN)、視索上核 (SON) 領域の RNA-seq を試みた。(1) について胎児脳を用いて検討を行なった。まずバゾプレシン・オキシトシンニューロンの下垂体後葉への軸索伸長時期を免疫染色で確認した。その結果、マウスでは胎生 14 日 (E14)-E16, ラットでは E16-E19 の間に、バゾプレシンニューロン軸索が下垂体後葉へ伸長することが確認された。一方、オキシトシンニューロン軸索は観察されず、出生後の新生児の時期に軸索伸長すると予想された。バゾプレシンニューロンに焦点を当て、軸索伸長関連因子の発現を免疫染色で検討した結果、バゾプレシンニューロン軸索自身や標的部位の下垂体で発現するいくつかの分子を同定した。(2) について、組織が大きいラット脳を用いて PVN, SON 領域の分散を実施した。先行研究を参考にパパインと Accutase による分散を実施した結果、パパインが有効と判断されたが、単細胞レベルまで十分に分散されてはいなかった。そこで、パパインの処理時間を長くした結果、分散度合は高まったが debris も多く出現した。そのため、現行の組織分散プロトコルのさらなる改良が必要であることが明らかとなった。

申请人表明，当下丘脑神经元诱导与小鼠ES细胞分化时，植入了成年小鼠的下丘脑时，植入的细胞轴突投射到垂体后腺。先前的研究表明，下丘脑中的轴突延伸可能涉及排斥性引导因素和细胞粘附分子，但是下丘脑 - 垂体系统中轴突引导机制的细节尚不清楚。因此，今年检查了（1）在下丘脑 - 垂体系统中的上述分子基团的表达。此外，我们尝试在下丘脑旁核核（PVN）和上核（SON）区域中进行RNA-Seq，目的是寻找新型的轴突延伸相关因素。（1）使用胎儿大脑检查。首先，通过免疫染色证实了轴突延伸到加压素 - 氧气毒素神经元的垂体后腺的时机。结果证实，在胚胎第14天（E14）-e16中，加压素神经元轴突延伸到垂体后腺体，在大鼠中延伸到E16-E19中。另一方面，未观察到催产素神经元轴突，预计在产后新生儿期间会生长轴突延伸。为了关注加压素神经元，我们通过免疫染色研究了与轴突延伸相关因子的表达，并鉴定出在轴突本身和目标位点的垂体中表达的几个分子。（2）：使用具有大组织的大鼠大脑进行PVN和SON区域的分散。根据先前的研究，使用木瓜蛋白酶和Accutase进行色散，尽管蛋白乳木瓜被确定为有效，但它不足以分散到单细胞水平。因此，由于增加了木瓜蛋白酶的治疗时间，分散程度增加了，但出现了许多碎屑。因此，这表明需要进一步改进当前的组织分散协议。