Translational control in skeletal muscle regeneration

骨骼肌再生的转化控制

• 批准号: 21K09218
• 负责人: 椎森 仁美
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K09218/
• 关键词: 骨格筋; 翻訳制御; CNOT4; ユビキチン転移酵素; 骨格筋再生; RNA

骨格筋筋線維の修復・再生過程は、運動機能のみならず個体の発生や恒常性維持に重要な役割を果たす。しかしながら、骨格筋修復・再生時における各素過程の分子基盤は未だ明らかではない。申請者はこれまでの研究から、遺伝子発現制御因子CCR4-NOT複合体の構成因子、ユビキチン転移酵素CNOT4がmRNA翻訳制御を介して、骨格筋修復・再生に機能する可能性を見出した。そこで、本研究では、骨格筋の修復・再生過程におけるCNOT4のユビキチン化標的因子とそれらによる翻訳制御機構の全体像を明らかにすることを目指して研究を進めている。令和4年度は、マウス筋芽細胞C2C12の野生型及びCNOT4ノックアウト株を用いて、C2C12細胞の分化誘導時におけるユビキチン化タンパク質検出系の確立を試みた。内在性のユビキチン化タンパク質のpull-downが可能である人工タンパク質を用いて解析を進めたが、発現レベルが低い内在のタンパク質については、そのユビキチン化は検出できなかった。そのため、トランスフェクション効率が高いHEK293T細胞を用いて翻訳関連因子のCNOT4依存的なユビキチン化状態の解析を行い、翻訳開始抑制因子である4E-BP1や4E-TがCNOT4依存的にユビキチン化されていることを明らかにした。さらに、筋分化の過程でのCNOT4の挙動をユビキチン化標的タンパク質を詳細に解析するため、マウスES細胞を用いたMyoD発現誘導による骨格筋細胞への分化系を確立し、解析を進めている。

骨骼肌纤维的修复和再生过程不仅在运动功能中发挥着重要作用，而且在个体发育和体内平衡中也发挥着重要作用。然而，骨骼肌修复和再生过程中每个基本过程的分子基础仍不清楚。通过前期研究，申请人发现泛素转移酶CNOT4（基因表达调节因子CCR4-NOT复合物的组成部分）可能通过mRNA翻译控制在骨骼肌修复和再生中发挥作用。因此，在本研究中，我们旨在阐明CNOT4泛素化靶因子及其在骨骼肌修复和再生过程中的翻译控制机制的整体情况。 2020年，我们尝试使用小鼠成肌细胞C2C12的野生型和CNOT4敲除株建立一个在C2C12细胞分化诱导过程中检测泛素化蛋白的系统。我们使用能够下拉内源性泛素化蛋白的人工蛋白进行分析，但我们无法检测到表达水平较低的内源性蛋白的泛素化。因此，我们利用转染效率高的HEK293T细胞分析了翻译相关因子的CNOT4依赖性泛素化状态，发现翻译起始抑制剂4E-BP1和4E-T以CNOT4依赖性方式泛素化据透露，确实有。此外，为了详细分析肌肉分化过程中CNOT4对泛素化靶蛋白的行为，我们通过使用小鼠ES细胞诱导MyoD表达，建立了骨骼肌细胞的分化系统，并正在进行分析。