肝の脂肪化における血清コリンエステラーゼ活性上昇とその性状

肝脏脂肪变性血清胆碱酯酶活性升高及其特征

基本信息

批准号：
20K10456
负责人：
平田幸代
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Nippon Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K10456/
关键词：
コリンエステラーゼ Sandwich ELISA オレイン酸 DELFIA 脂肪肝

项目摘要

①血清ChEのSandwich ELISAの再現性、安定性、感度の向上:昨年度に引き続き、DELFIAを用いた測定法についてさらに検討を行った。バックグラウンドの低い蛍光用マイクロプレートを採用し、時間分解蛍光の測定条件を変更することで再現性や安定性が改善したものの、感度はテトラメチルベンジジンによる発色のELISAと比べ２倍程度であり、大きく向上させることはできなかった。②In vitroの脂肪肝モデルを用いた脂肪蓄積量とChEとの関連性の検討:１）OAの濃度変化における脂肪蓄積量への影響：HuH-7細胞をカルチャーカバーガラスへ播種し、OA添加24時間後に固定し、Oil Red O溶液およびヘマトキシリン溶液で染色した。OA濃度の上昇に伴い、脂肪滴が大きくなり、数も増加した。画像解析により細胞当たりの脂肪滴の面積を比較したところ、OA濃度の上昇に伴い細胞当たりの脂肪滴の面積は増加し、今回添加したOAの最大濃度である0.6mMは0mMの約74倍であった。２）OAの濃度変化によるChE発現および抗原量への影響：HuH-7細胞を48wellプレートへ播種し、24時間後に種々の濃度でOAを添加し、添加後9日目と12日目にtotal RNAおよび培養上清を採取した。RT-PCRによりG3PDHをコントロールとしてChEのmRNA量およびChE抗原量の測定を行ったところ、OA濃度の上昇に伴い、ChEのmRNA量、培養上清中のChE抗原量はともに増加傾向を示した。以上の結果から、OA添加による脂肪蓄積の上昇とChE抗原量および発現量は正の相関性が見られ、OAによる脂肪の産生あるいは蓄積とChEには関連がある可能性が考えられた。

①提高血清ChE夹心ELISA的重现性、稳定性和灵敏度：继去年之后，我们进一步研究了DELFIA的测定方法。虽然通过使用低背景荧光微孔板和改变时间分辨荧光的测量条件提高了重现性和稳定性，但灵敏度约为使用四甲基联苯胺的 ELISA 的两倍。 ② 利用体外脂肪肝模型检验脂肪积累与 ChE 的关系： 1) OA 浓度变化对脂肪积累的影响：将 HuH-7 细胞接种于培养盖玻片上，加入 OA 24 小时后，用油红O溶液和苏木精溶液固定并染色。随着OA浓度的增加，脂滴变大并且数量增加。通过图像分析比较每个细胞的脂滴面积，我们发现每个细胞的脂滴面积随着OA浓度的增加而增加，而本次添加的OA最大浓度0.6mM，约为74倍0mM 的。 2)OA浓度变化对ChE表达和抗原量的影响：将HuH-7细胞接种于48孔板中，24小时后加入不同浓度的OA，收集总RNA和培养上清。当使用G3PDH作为对照通过RT-PCR测量ChE mRNA量和ChE抗原量时，培养物上清液中的ChE mRNA量和ChE抗原量都显示出随着OA浓度增加而增加的趋势。从以上结果可以看出，添加OA引起的脂肪积累增加与ChE抗原的量和表达量呈正相关，表明OA和ChE引起的脂肪产生或积累之间可能存在关系。