肝の脂肪化における血清コリンエステラーゼ活性上昇とその性状

肝脏脂肪变性血清胆碱酯酶活性升高及其特征

基本信息

批准号：
20K10456
负责人：
平田幸代
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Nippon Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K10456/
关键词：
コリンエステラーゼ Sandwich ELISA オレイン酸 DELFIA 脂肪肝

项目摘要

①血清ChEのSandwich ELISAの再現性、安定性、感度の向上:昨年度に引き続き、DELFIAを用いた測定法についてさらに検討を行った。バックグラウンドの低い蛍光用マイクロプレートを採用し、時間分解蛍光の測定条件を変更することで再現性や安定性が改善したものの、感度はテトラメチルベンジジンによる発色のELISAと比べ２倍程度であり、大きく向上させることはできなかった。②In vitroの脂肪肝モデルを用いた脂肪蓄積量とChEとの関連性の検討:１）OAの濃度変化における脂肪蓄積量への影響：HuH-7細胞をカルチャーカバーガラスへ播種し、OA添加24時間後に固定し、Oil Red O溶液およびヘマトキシリン溶液で染色した。OA濃度の上昇に伴い、脂肪滴が大きくなり、数も増加した。画像解析により細胞当たりの脂肪滴の面積を比較したところ、OA濃度の上昇に伴い細胞当たりの脂肪滴の面積は増加し、今回添加したOAの最大濃度である0.6mMは0mMの約74倍であった。２）OAの濃度変化によるChE発現および抗原量への影響：HuH-7細胞を48wellプレートへ播種し、24時間後に種々の濃度でOAを添加し、添加後9日目と12日目にtotal RNAおよび培養上清を採取した。RT-PCRによりG3PDHをコントロールとしてChEのmRNA量およびChE抗原量の測定を行ったところ、OA濃度の上昇に伴い、ChEのmRNA量、培養上清中のChE抗原量はともに増加傾向を示した。以上の結果から、OA添加による脂肪蓄積の上昇とChE抗原量および発現量は正の相関性が見られ、OAによる脂肪の産生あるいは蓄積とChEには関連がある可能性が考えられた。

1）血清CHE的三明治ELISA的可重复性，稳定性和灵敏度的提高：从去年开始，对使用Delfia的测量方法进行了进一步的考虑。尽管采用低背景荧光微孔板并更改时间分辨荧光的测量条件，可改善可重复性和稳定性，但敏感性大约是ELISA的两倍，ELISA的敏感性是用四甲基苯甲酰氨酸染色的，并且无法显着改善。 2）使用体外脂肪肝模型研究脂肪积累与CHE之间的关系：1）OA浓度变化对脂肪积累的影响：HUH-7细胞在培养覆盖层上播种，添加OA后24小时固定，并用油红O溶液和苏毒素溶液染色。随着OA浓度的增加，脂质液滴增加，数量增加。当使用图像分析比较每个细胞的脂质液滴面积时，每个细胞的脂质液滴面积随着OA浓度的增加而增加，这次添加的OA最大浓度为0.6mm，约为0mm的74倍。 2）OA浓度变化对CHE表达和抗原含量的影响：HUH-7细胞被接种到48孔板中，24小时后以各种浓度添加OA，并在添加后的第9和12天收集了总RNA和培养上清液。当使用G3PDH作为RT-PCR对照测量CHE mRNA和CHE抗原量时，培养上清液中CHE mRNA和CHE抗原量的量显示出随着OA浓度升高而增加的趋势。从上述结果中可以发现，由于添加OA而导致的脂肪积累增加以及CHE抗原和表达水平的数量正相关，并且人们认为OA和CHE引起的脂肪的产生或脂肪的积累之间可能存在联系。