Analysis for composition of Kaposi's sarcoma associated herpesvirus-host hybrid complex and discovery for drug targets

卡波西肉瘤相关疱疹病毒-宿主混合复合物的组成分析及药物靶点的发现

基本信息

批准号：
21K08509
负责人：
渡部匡史
金额：
$ 2.66万
依托单位：
University of the Ryukyus
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

新規近位依存性標識法を用いた宿主性vPIC相互作用因子の同定に向けてvPIC因子であるORF34またはORF66欠損ウイルス産生細胞に対して，近位依存性標識タグ付加ORF34またはORF66発現プラスミドを導入し，定常発現細胞を前年度までに樹立していた．これらの細胞においてウイルス複製が正常に進行しているか，近位依存性標識タグが機能しているかについて確認したものの，因子同定に至ることのできる機能的条件を十分に満たす結果が得られていない．そのため，代替方策を準備・検討している．ウイルス性vPIC因子の機能性領域の同定については，vPICのハブとして機能しうるORF34に着目し解析を進めてきた．具体的にはヘルペスウイルスホモログ間での保存アミノ酸についてアラニン置換体を18種作成し，各種性状解析に供した．得られた実験結果に関してクラスター解析を実施するとともに，Deep-learningによるタンパク質構造予測アルゴリズムAlphaFold2による予測構造モデルとの照合を実施し，分子機能とタンパク質構造との関連性について検討した．いくつかの知見は得られたが，少なくともORF34上に存在する4つのシステイン残基に関しては，ドメイン構造維持を介して分子機能保持に重要な役割を担っている可能性が強く示唆されたと考えている．上記の内容を論文投稿し，さらにプレプリントサーバBioRxiv上で公開している(Watanabe T. et al., bioRxiv., 2023 doi: 10.1101/2023.03.08.531831. Preprint.)．また補助プロジェクトとして進めていたvPIC因子間(ORF18-ORF30)相互作用に関する内容が，原著論文として受理された(Maeda Y., Watanabe T. et al., Int. J. Mol. Sci. 2022)．

将带有近端依赖性标记标签的 ORF34 或 ORF66 表达质粒引入缺乏 ORF34 或 ORF66（vPIC 因子）的病毒产生细胞中，以使用新型近端依赖性标记方法鉴定宿主介导的 vPIC 相互作用因子。恒定表达细胞已于前一年建立。尽管我们已经证实这些细胞中病毒复制是否正常进行以及近端依赖性标记标签是否发挥作用，但我们尚未获得完全满足识别该因子的功能条件的结果．因此，我们正在准备并考虑替代措施。关于病毒vPIC因子功能区的鉴定，我们重点分析了ORF34，它可以作为vPIC的枢纽。具体来说，我们为疱疹病毒同源物中的保守氨基酸创建了 18 种丙氨酸取代产物，并对它们进行了各种表征分析。除了对获得的实验结果进行聚类分析外，我们还利用深度学习蛋白质结构预测算法AlphaFold2通过预测结构模型验证了结果，以检验分子功能与蛋白质结构之间的关系。尽管获得了一些发现，但强烈表明ORF34上存在的至少四个半胱氨酸残基可能通过维持结构域结构在维持分子功能方面发挥重要作用。上述内容已作为论文提交，并发表在预印本服务器BioRxiv上（Watanabe T. et al., bioRxiv., 2023 doi: 10.1101/2023.03.08.531831. Preprint.）。此外，作为附属项目正在推进的vPIC因子之间的相互作用（ORF18-ORF30）的内容被接受为原始论文（Maeda Y.，Watanabe T.等人，Int. J. Mol. Sci 2022）。