Development of high efficacy human iPS generating using mRNA

开发利用 mRNA 产生高效人类 iPS

• 批准号: 20K09155
• 负责人: 千本松 孝明
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Saitama Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K09155/
• 关键词: ヒトiPS細胞; 患者残余検体; mRNA; インターフェロン; iPS

iPS細胞誘導時にゲノム点突然変異や遺伝子コピー変異等が確率的に混入し、iPS細胞としての品質は安定せず、臨床応用とりわけ安全面との間に大きな溝が残されている。加えて患者組織、すなわち治療過程で摘出された病的素因を有した組織（残余検体）もしくは老化が進んだ組織を用いてヒトiPS誘導した場合は極端に誘導効率は低下する。再生医療を必要とする変性疾患患者や高齢者の自家組織から誘導された良質なiPS細胞こそが本来必要とするiPS細胞と考える。このプロジェクトでは、宿主細胞へのダメージが最も少ないと考えられる山中因子mRNAを用いて高効率なヒトiPS細胞の誘導法を確立し、誘導されたヒトiPS細胞の品質を評価していく。初年度から2年度は、Self-replicative RNA vectorからのRNAの精製効率の向上及び巨大mRNA導入による宿主細胞インターフェロン放出による細胞死を抑制のための実験系確立に注力した。SiRNA等の小さいRNAの導入とは異なり、巨大mRNAの導入では宿主細胞からのインターフェロン放出はどうしても避けられない。ほとんどの細胞は導入数日内に死滅に至ってしまう。そこでインターフェロン抑制剤B18Rの高濃度環境を構築してクリアーした。3年度以降はSelf-replicative human Tet-1 RNA vectorを作製し、これまでに確立し方法を組み合わせて、より高効率なヒトiPS細胞誘導法の検証を行った。現在これらの方法を用いて患者細胞や老化細胞をから分別された体細胞を用いてもヒトiPS細胞が誘導可能か、更にはこれらの細胞を用いて心筋細胞が誘導可能かの最終段階検証に入っているが、効率の検証が不十分であったため、1年間延長を申請させて頂き、検証作業を現在行っている。

iPS细胞衍生过程中随机引入基因组点突变和基因拷贝突变，iPS细胞质量不稳定，在临床应用尤其是安全性方面存在较大差距。此外，当使用患者组织，即在治疗过程中去除的具有病理倾向的组织（残留样本）或老化组织来诱导人类iPS时，诱导效率极大地降低。我们相信，源自退行性疾病患者和需要再生医学的老年人的自体组织的高质量iPS细胞才是最初需要的iPS细胞。在本项目中，我们将利用山中因子mRNA建立一种高效的人iPS细胞诱导方法，该方法被认为对宿主细胞造成的损害最小，并评估诱导的人iPS细胞的质量。从第一年到第二年，我们专注于提高自复制RNA载体的RNA纯化效率，并建立通过引入大mRNA来抑制宿主细胞干扰素释放导致的细胞死亡的实验系统。与引入SiRNA等小RNA不同，引入大mRNA时，宿主细胞释放干扰素是不可避免的。大多数细胞在引入后几天内死亡。因此，我们通过创造一个含有高浓度干扰素抑制剂 B18R 的环境来解决这个问题。从第三年开始，我们创建了自我复制的人类Tet-1 RNA载体，并结合之前建立的方法来验证更有效的人类iPS细胞诱导方法。我们目前正处于验证是否可以使用从患者细胞和衰老细胞中分离的体细胞通过这些方法诱导人 iPS 细胞，以及是否可以使用这些细胞诱导心肌细胞的最后阶段，但是，由于效率验证不充分，我们目前处于最后阶段。已申请延期一年，目前核查工作正在进行中。