Vasohibin-2による横紋筋肉腫の悪性化制御機構の解明と新規治療法の開発

阐明Vasohibin-2控制横纹肌肉瘤恶性进展的机制并开发新的治疗方法

基本信息

批准号：
21K07089
负责人：
鈴木康弘
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

バキュロウイルスによる蛋白発現系でGFPを付与したVASH2-SVBP複合体とVASH1-SVBP複合体および各種VASH変異体-SVBP複合体蛋白の合成と精製を行い、ポリエチレングリコールを含有するバッファー内における液-液相分離現象を確認したところ、VASHのα-チューブリン脱チロシン化活性を欠損する変異体とVASHのN末端とC末端にある天然変性（disorder）領域を双方とも欠損する変異体においても野生型VASHと同様に液-液相分離を誘導することを確認した。また、VASHのN末側order領域の一部を欠損することによって、VASH-SVBP複合体形成に明確な影響は認められないが、蛋白安定性が減弱する傾向が確認された。NanoLucルシフェラーゼ断片と高い親和性のあるHiBiTタグをC末端に付与した各種VASH2変異体とSVBPを細胞に強制発現させ、細胞が合成するVASH2-SVBP複合体の細胞内蛋白量と培養液中の細胞外分泌量をルシフェラーゼ活性で測定したところ、SVBPとの複合体形成に必要とされるVASH2側のアミノ酸配列に変異を加えることで、野生型と比して変異VASH2の細胞内蛋白量と細胞外分泌量が連動して減少することを確認した。精製VASH2-SVBP 複合体は細胞外刺激性に培養血管内皮細胞の機能に明確な影響を与えなかった。VASH2 mRNAのExon7を標的とするアンチセンスオリゴをヒト胞巣型横紋筋肉腫細胞株に導入することによって、細胞内のVASH2蛋白量が減少し、これに伴いα-チューブリンの脱チロシン化レベルが抑制されることを確認した。

使用杆状病毒蛋白表达系统合成和纯化 VASH2-SVBP 复合物、VASH1-SVBP 复合物和添加了 GFP 的各种 VASH 突变体-SVBP 复合物蛋白，并在含有聚乙二醇的缓冲液中的液-液溶液中使用它们。相分离发展我们证实，缺乏VASH的α-微管蛋白脱酪氨酸活性的突变体和缺乏VASH的N端和C端自然无序区域的突变体与野生型VASH相似，并证实了液-液相。类似地诱导分离。此外，删除VASH N端部分有序区域对VASH-SVBP复合物的形成没有明显影响，但证实了蛋白质稳定性减弱的趋势。我们迫使细胞表达带有 HiBiT 标签的 SVBP 和各种 VASH2 突变体，该标签对 C 末端的 NanoLuc 荧光素酶片段具有高亲和力。通过荧光素酶活性测定，我们发现，通过在与SVBP形成复合物所需的VASH2的氨基酸序列上添加突变，突变型VASH2的细胞内蛋白量和细胞外分泌量与野生型相比是相关的。证实这种情况会减少。纯化的VASH2-SVBP复合物对培养的血管内皮细胞在细胞外刺激下的功能无明显影响。通过将针对 VASH2 mRNA 外显子 7 的反义寡核苷酸导入人肺泡横纹肌肉瘤细胞系，细胞内 VASH2 蛋白的量减少，α-微管蛋白脱酪氨酸水平降低。