IgEの架橋活性を指標とする新規セルフリーアレルギー試験法の開発

以IgE交联活性为指标开发新的无细胞过敏测试方法

基本信息

批准号：
20K08782
负责人：
秋山晴代
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Teikyo Heisei University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08782/
关键词：
EXiLE法架橋 FcεRI セルフリー IgE

项目摘要

アレルギー試験法EXiLE法は、ヒトの高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現させた培養マスト細胞株を、アレルギー患者血清(IgE)で感作し、抗原添加による細胞の活性化をルシフェラーゼアッセイにより検出する手法で、高感度にIgEの「架橋活性」を評価できる画期的な試験法である。しかし一方で、本法では一部の血清や抗原が細胞障害性を示し正確な測定が出来ない問題に直面している。そこで本研究では、EXiLE法の特徴を活かし、「架橋」を指標とした新しい「セルフリー型」アレルギー試験法の開発を主目的とする。具体的には、ルシフェラーゼ相補性システムを利用して各種発光タグ融合FcεRI α鎖を作製し、セルフリー条件下IgEと抗原結合により導かれるFcεRIの架橋を評価する新しいアレルギー試験系を開発する。昨年度は、T7プロモーターを有しているHaloTag(HT)用ベクターのN末端側とC末端側にFcεRI α－レポーター(NanoBit)配列(4通り)を挿入した遺伝子を作製し、大腸菌抽出液を利用した無細胞系によるタンパク精製を行った。本年度は、収量および純度の高いリコンビナントタンパク質の精製を目指し、検討をおこなった。無細胞系によるタンパク質合成における誘導時間、温度、振とう速度等の条件検討を実施したところ、収量に変化は見られなかった。次に、PEIを用いてHEK293T細胞へのトランスフェクションを行った。しかし目的タンパク質を大量に発現させるまでには至らなかった。セルフリー条件下IgEと抗原結合によるFcεRIの架橋を評価するためには大量のリコンビナントタンパク質が必須であるため、今後、動物細胞によるタンパク質精製に適したベクターを用いた新たな遺伝子の作製や大腸菌を用いたタンパク精製を試みる。

过敏测试方法 EXiLE 涉及用过敏患者血清 (IgE) 致敏表达高亲和力人类 IgE 受体 (FcεRI) 的培养肥大细胞系，然后使用荧光素酶测定来确定添加抗原对细胞的激活情况这是一种突破性的测试方法，可以高度灵敏地评估 IgE 交联活性。然而，这种方法面临着一些血清和抗原具有细胞毒性的问题，使得精确测量变得不可能。因此，本研究的主要目的是利用EXiLE方法的特点，开发一种新的以“交联”为指标的“无自我”过敏测试方法。具体来说，我们将使用荧光素酶互补系统来创建各种发光标签融合的FcεRI α链，并开发一种新的过敏测试系统，用于评估无细胞条件下IgE和抗原结合诱导的FcεRI交联。去年，我们通过将 FcεRI α-报告基因（NanoBit）序列（4 种）插入具有 T7 启动子的 HaloTag（HT）载体的 N 末端和 C 末端，并使用大肠杆菌提取物创建了一个基因。使用无细胞系统进行蛋白质纯化。今年，我们进行了研究，目的是纯化高产量和高纯度的重组蛋白。当使用无细胞系统研究蛋白质合成的诱导时间、温度和振荡速度等条件时，没有观察到产量的变化。接下来，使用 PEI 转染 HEK293T 细胞。然而，目标蛋白无法大量表达。由于大量的重组蛋白对于评估无细胞条件下 IgE 与 FcεRI 的交联和抗原结合至关重要，因此我们将继续尝试使用适合使用动物细胞和大肠杆菌进行蛋白纯化的载体来开发新基因。使用纯化蛋白质