Construction of Multiple Sample Analysis System Using FRET System and Search for Inhibitors of Virus Polymerization Proteins

利用FRET系统构建多样品分析系统并寻找病毒聚合蛋白抑制剂

基本信息

批准号：
21K06872
负责人：
上大介
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06872/
关键词：
FRET 阻害剤多検体解析ウイルス由来重合タンパク質

项目摘要

RNAウイルスSARS-CoV-2は世界中で大流行し、治療薬の開発競争が激化している。治療薬のターゲット分子はウイルスの表面抗原やRNAポリメラーゼが多く、細胞内で増加したウイルスゲノムRNA除去を目指した治療薬開発は報告がない。このゲノムRNAはNucleocapsid protein (N protein)と結合、さらにN protein同士で重合することで、細胞内で安定化する。本研究はSARS-CoV-2のN proteinの重合を阻害する低分子化合物をハイスループットシステムにて探索し、重合阻害の有効性をvitroにて証明することを目的としている。そこで我々は重合化を評価できるFRETシステムとイメージングサイトメータを用いたシステムを設計・構築した。このシステムを用いて、重合阻害を可能にする低分子化合物を探索し、そのゲノムRNAの安定性をvitroにて解析する。これらの結果と解析システムの構築はN proteinをもつ数多くのウイルスに対する新たな治療薬の開発の先駆的な手法となりえる。今年度は前年度で問題点を解決した新しいベクター構築を行い、その評価を行ってみたが、予定の結果は得られなかった。そこでレトロウイルスを用いて安定発現株を樹立し、シングルセルクローニングを行った。取得した細胞はIn Cell Analyzer2200にて撮像し、FRETのポジティブコントロール、ネガティブコントロール株と比較した。

RNA病毒SARS-CoV-2已在世界范围内传播，开发治疗药物的竞争正在加剧。治疗药物的靶分子大多是病毒表面抗原和RNA聚合酶，尚无开发旨在去除细胞内增加的病毒基因组RNA的治疗药物的报道。这种基因组 RNA 通过与核衣壳蛋白（N 蛋白）结合并相互聚合而在细胞内稳定。本研究的目的是利用高通量系统寻找抑制SARS-CoV-2 N蛋白聚合的低分子量化合物，并证明体外抑制聚合的有效性。因此，我们设计并构建了一个使用 FRET 系统和成像细胞仪来评估聚合的系统。利用该系统，我们将寻找能够抑制聚合的低分子化合物，并分析其基因组RNA在体外的稳定性。这些结果和分析系统的构建可以作为针对多种含有N蛋白的病毒开发新治疗药物的开创性方法。今年，我们构建了一个新的向量，解决了前一年的问题并对其进行了评估，但我们没有得到预期的结果。因此，我们利用逆转录病毒建立了稳定表达株并进行了单细胞克隆。使用 In Cell Analyzer 2200 对获得的细胞进行成像，并与 FRET 阳性对照和阴性对照菌株进行比较。