新規アルギニン水酸化酵素の電子伝達系の同定と抗結核薬の大量生産システムの確立

新型精氨酸羟化酶电子传递链的鉴定及抗结核药物规模化生产体系的建立

基本信息

批准号：
21K06629
负责人：
熊谷孝則
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は, 昨年度構築した発現系を利用して, フェレドキシン（FDX）およびFDX還元酵素（FDR）を精製し, D-サイクロセリン（D-CS）生合成に関与する新規アルギニン水酸化酵素DcsAの電子伝達系を明らかにするとともに, 抗癌剤ヒドロキシウレア（HU）の大腸菌を宿主とした生産系を構築することを目標として研究を実施した。まず, 昨年度構築した発現系を利用して, 各FDX（7種）およびFDR（2種）の発現性をSDS-PAGEにより調査した。その結果, 3種のFDX（Sla_0278, Sla_2106, Sla_5080）, および, 2種のFDR（Sla_0456, Sla_5644）が可溶性タンパク質として発現することが明らかになった。そこで, クロマトグラフィーの手法を用いることにより, これらタンパク質の精製を行った。その結果, 全てについて, ほぼ単一タンパク質として精製することに成功した。続いて, 精製したタンパク質について, 吸収スペクトル解析（260～600 nm）を実施した。その結果, 3種のFDXのうち, Sla_0278およびSla_5080については, 鉄/硫黄タンパク質に特徴的な吸収スペクトルが観測されたが, Sla_2106については観測されなかった。一方, 2種のFDRについては, フラビンタンパク質に特徴的な吸収スペクトルは観測されなかった。以上本年度においては, FDXおよびFDRをほぼ単一タンパク質として取得したが, FDRについては活性型と考えられるタンパク質を取得できなかった。そのため, 当初の研究計画では目標を達成することが困難になったので, 次年度は方針を変更して研究を継続する。

今年，我们将利用去年构建的表达系统来纯化铁氧还蛋白（FDX）和FDX还原酶（FDR），并纯化DcsA的电子，DcsA是一种参与D-环丝氨酸（D-CS）生物合成的新型精氨酸羟化酶。开展研究的目的是阐明以大肠杆菌为宿主的抗癌药物羟基脲（HU）的递送系统并构建生产系统。首先，使用去年构建的表达系统，通过SDS-PAGE研究了每种FDX（7种）和FDR（2种）的表达特性。结果显示，三种类型的FDX（Sla_0278、Sla_2106、Sla_5080）和两种类型的FDR（Sla_0456、Sla_5644）以可溶性蛋白的形式表达。因此，我们使用色谱法纯化这些蛋白质。结果，我们成功地将几乎所有它们纯化为单一蛋白质。接下来，对纯化的蛋白质进行吸收光谱分析（260-600 nm）。结果，三种类型的FDX中，Sla_0278和Sla_5080观察到了铁/硫蛋白的吸收光谱特征，但Sla_2106没有观察到。另一方面，两种类型的 FDR 均未观察到黄素蛋白的吸收光谱特征。如上所述，今年我们获得了几乎为单一蛋白质的FDX和FDR，但未能获得被认为是FDR活性形式的蛋白质。这样一来，原来的研究计划的目标就很难实现了，所以明年我们会改变政策，继续研究。