Bcl6の肝臓特異的転写制御ネットワークの解明とNASH創薬への応用

Bcl6 肝脏特异性转录调控网络的阐明及其在 NASH 药物发现中的应用

• 批准号: 20K08394
• 负责人: 近田 裕美
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08394/
• 关键词: Bcl6; Bcl6相互作用因子群; NASH; B cell lymphoma 6; 転写制御ネットワーク; 肝臓; 非アルコール性脂肪性肝炎NASH

我々は、科研費特別研究員奨励費による研究の成果として、Bcl6が非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）発症に関与することを肝臓特異的欠損マウスを用いて証明した。Bcl6の分子機能については、B細胞等の免疫細胞ではBCoR等と複合体を形成し、抑制性の転写因子として機能することが報告されている。一方で、肝臓におけるBcl6の分子機能に関する報告はほとんどない。本研究では、肝臓でのBcl6の分子機能を明らかにし、NASH発症メカニズムの解明・Bcl6およびその下流シグナルをターゲットにしたNASH治療薬の創薬を目的とする。そこで、アデノ随伴ウィルス（AAV）による個体肝臓での遺伝子発現系を用いて、肝臓特異的なBcl6相互作用因子群を精製・同定し、機能解析を行う予定であったが、研究代表者の身分変更に伴い、中途終了となった。予備的な検討において、Bcl6を過剰発現した個体肝臓は軽度の脂肪肝が誘導されており、この脂肪肝から比重遠心法で肝細胞を単離するのは困難であることが分かった。そこで、新たな肝臓の核単離方法として、スクロース濃度と遠心を利用する方法を検討した。この結果、健常肝臓および脂肪肝の両方で核を単離することに成功した。次にこの方法を用いて、AAV-ControlおよびAAV-hBcl6-FLAGをオスマウスに腹腔内投与した3日後の肝臓から核を単離し、核タンパク質を抽出した。この核タンパク質を用いて、Anti-FLAG M2 agarose affinity gelを用いた免疫沈降およびFLAGペプチドによる溶出を行い、Bcl6相互作用因子群を精製した。この精製サンプルに対して、質量分析測定を行い、Bcl6相互作用因子群を同定したが、細胞質由来と考えられるタンパク質が多く検出され、核由来のBcl6に特異的な相互作用因子群を見出すのが困難であった。このことから、核タンパク質抽出方法を改良する必要があると考えられた。

作为由科学研究补助金资助的研究结果，我们使用肝脏特异性缺陷小鼠证明了 Bcl6 参与非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 的发展。关于Bcl6的分子功能，据报道，其与B细胞等免疫细胞中的BCoR等形成复合物，作为抑制性转录因子发挥功能。另一方面，关于Bcl6在肝脏中的分子功能的报道很少。本研究旨在阐明Bcl6在肝脏中的分子功能，阐明NASH的发病机制，并寻找针对Bcl6及其下游信号的治疗NASH的药物。因此，我们计划使用腺相关病毒（AAV）在个体肝脏中利用基因表达系统纯化和鉴定一组肝脏特异性Bcl6相互作用因子，并进行功能分析，由于变化，中途停止。在初步研究中，我们发现Bcl6过度表达个体的肝脏中诱发了轻度脂肪肝，并且很难通过比重离心从这些脂肪肝中分离出肝细胞。因此，我们研究了一种利用蔗糖浓缩和离心分离肝细胞核的新方法。结果，我们成功地从健康肝脏和脂肪肝脏中分离出细胞核。接下来，使用该方法，在腹腔内施用AAV-Control和AAV-hBcl6-FLAG 3天后，从雄性小鼠的肝脏中分离细胞核，并提取核蛋白。使用该核蛋白，使用抗FLAG M2琼脂糖亲和凝胶进行免疫沉淀并使用FLAG肽进行洗脱，以纯化Bcl6相互作用因子组。我们对该纯化样品进行了质谱测量，并鉴定了一组 Bcl6 相互作用因子，但检测到了许多被认为源自细胞质的蛋白质，因此很难找到一组源自细胞核的 Bcl6 特异性相互作用因子。很困难。由此认为有必要改进核蛋白提取方法。