ウイルスベクターに適した粉末製剤設計による経肺・経鼻投与型遺伝子吸入粉末剤の開発

通过设计适合病毒载体的粉末配方，开发用于肺和鼻给药的基因吸入粉末

基本信息

批准号：
21K06501
负责人：
奥田知将
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Meijo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度には、アデノ随伴ウイルスベクター (AAVV)の吸入粉末剤開発に向けた基礎的情報の集約を目的として、培養細胞およびマウスにおけるAAVVの遺伝子発現特性を検証した。また、小スケールで多検体調製が可能な凍結乾燥 (FD)法を基に、AAVVの粉末製剤化を試み、AAVVの機能を保持可能な添加剤の探索を行った。計3種のヒト由来肺がん細胞株を用いて、AAVVによる遺伝子発現効果を比較したところ、Calu-3細胞 < A549細胞 < NCI-H441細胞の順で効果に差が認められた。また、NCI-H441細胞を用いて、AAVVの血清型による遺伝子発現効果を比較したところ、9型 < 1型 < 6型の順で効果が高かった。このAAVVの血清型による遺伝子発現効果の違いについては、マウスに経気道投与した際の肺内遺伝子発現効果とある程度相関していた。また、肺内遺伝子発現効果の時間推移について、投与2週間前後で最大となり、投与2か月後でも効果が認められた。製造した種々のAAVV含有FD製剤について、NCI-H441細胞での遺伝子発現効果を比較したところ、タンパクなどの凍結乾燥保護剤として広く知られているトレハロースよりもAAVVの機能保持に優れた高分子添加剤Xを新たに見出し、粉末製剤化後もAAVV原液とほぼ同様の遺伝子発現効果が得られることを明らかにした。また、この添加剤XによるAAVVの機能保持効果について、①AAVVの血清型および添加剤Xの分子量に依らず同様に得られること、②比較的少量添加でも得られること、③吸入剤応用に向けて添加剤Xの一部を他の分散補助剤で置換した場合でも得られること、を見出した。保存安定性について、溶液状態よりも粉末状態の方が室温での保存においてAAVVの遺伝子発現効果を維持できることが示唆されたが、粉末状態でも長期保存には- 20℃以下での保存が適していた。

今年，我们验证了AAVV在培养细胞和小鼠中的基因表达特征，旨在为腺相关病毒载体（AAVV）吸入粉末制剂的开发收集基础信息。我们还尝试基于冷冻干燥（FD）方法将AAVV配制为粉末制剂，该方法允许小规模制备多个样品，并寻找可以保持AAVV功能的添加剂。当使用总共三种人源肺癌细胞系比较AAVV的基因表达效果时，观察到效果差异的顺序为Calu-3细胞<A549细胞<NCI-H441细胞。此外，当我们使用NCI-H441细胞比较AAVV血清型的基因表达效果时，效果按9型<1型<6型的顺序最高。这种基因表达效应的差异取决于 AAVV 血清型，在某种程度上与通过气道给予小鼠时肺部的基因表达效应相关。另外，关于对肺部基因表达的影响的时间进程，在给药后约2周左右达到最大效果，甚至在给药后2个月也观察到效果。对各种制造的含有 AAVV 的 FD 制剂在 NCI-H441 细胞中的基因表达效果的比较表明，在保留 AAVV 功能方面，添加聚合物优于海藻糖（海藻糖被广泛认为是蛋白质的冻干保护剂）。新发现的代理另外，关于由该添加剂引起的AAVV的功能保持效果，已发现即使当用另一种分散助剂代替部分添加剂X时也可以获得该效果。关于储存稳定性，有人认为粉末形式的AAVV在室温下比溶液状态能更好地维持基因表达效果，但即使是粉末形式，-20℃或更低的温度也适合长期保存塔。