口腔・腸内細菌と濾胞性ヘルパーT細胞を標的とした自己免疫性肝炎の病態解明

阐明针对口腔/肠道细菌和滤泡辅助 T 细胞的自身免疫性肝炎的病理学

• 批准号: 20K08290
• 负责人: 阿部 和道
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Fukushima Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K08290/
• 关键词: 自己免疫性肝炎; 腸内細菌叢; Veillonella dispar; Tfh細胞; 口腔・腸内細菌叢; 濾胞性ヘルパーT細胞; Veillonella; 口腔・腸内細菌

AIHマウスモデル作成：メスC57BL/6マウスの肝臓から精製したS-100抗原タンパク（0.5-2mg/mLを0.5mL）とcomplete Freund’s adjuvant(CFA、0.5mL)をメスC57BL/6マウスにday0、day7に腹腔内投与し、4週間後に慢性肝炎を発症しAIHマウスモデルを作成。いずれのAIHモデルも頬静脈採血、麻酔として混合薬（ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW）を腹腔内投与して心採血、頸椎脱臼で安楽死させたのちに、肝臓を採取する。 血漿のALT、IgG、抗核抗体、また肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色で評価しAIHモデルとなっているか確認する。ALTの上昇や肝組織の炎症が弱いので繰り返しモデル作成を試みる。AIHマウスモデルに抗菌薬[オートクレーブ水1Lで1g/Lアンピシリン1g/L、ネオマイシン1g/L、バンコマイシン0.5g/L、メトロニダゾール1g/L、甘味料（Sweetener Sweet’n Low、サッカリン）60g/Lを溶解し、100mL/ボトルを週2回置き換える]の飲料水経由で7日間腸管除菌する。PBSで希釈した口腔細菌1x108CFU/200μl（Veillonella dispar：株式会社KACから購入）を経口ゾンデを用いて経口投与し、4週間後に、頬静脈採血し、麻酔として混合薬（ドミトール0.15ml/ドルミカム0.8ml/ベトルファール1ml、100μl/10g BW）を腹腔内投与して心採血、その後頸椎脱臼で安楽死させ、肝臓、腸管、便を採取する。その後次世代シーケンサ・アンプリコン解析を用いてマウス便の腸内細菌叢の変化、肝組織をHematoxylin Eosin染色とAzan染色を用いて肝炎発症や重症化、軽減の有無を確認する。今後、AIHマウスモデルにFITC-dextranを用いて腸管透過性を評価する.AIHマウスモデルから腸管, 肝臓を摘出し, フローサイトメトリーや免疫染色でTfh細胞の数や浸潤程度, 機能を解析する.

创建AIH鼠标模型：S-100抗原蛋白（0.5-2mg/ml 0.5ml）从雌性C57BL/6小鼠的肝脏中纯化和完整的Freund调节（CFA，0.5ML），在第7天和第7天对女性C57BL/6小鼠/6小鼠和慢性肝炎进行了腹膜内的腹膜内，并创建了一个四个星期的模型。在这两种AIH模型中，混合药物（Domitol 0.15 mL/多龙0.8 ml/bettlefaal 1 ml，100μl/10 g BW）腹膜内施用以收集心脏血液，并通过颈椎脱位安乐死，然后收集肝脏。使用苏木精植物和Azan染色评估血浆ALT，IgG，抗核抗体和肝组织，以确认是否使用了AIH模型。由于Alt升高和肝组织炎症很弱，因此我们尝试反复创建一个模型。 Disinfect the antibiotics [1 g/L ampicillin 1 g/L, neomycin 1 g/L, vancomycin 0.5 g/L, metronidazole 1 g/L, and 60 g/L sweetener (Sweetener Sweet'n Low, saccharin) in an AIH mouse model for 7 days via drinking water with an antibiotic [1 g/L ampicillin 1 g/L, vancomycin 0.5 g/l，甲硝唑1 g/l，每周两次100毫升/瓶子]。口服细菌1x108cfu/200μl（Veillonella dispar：从PBS中稀释的KAC Co.，Ltd。购买）的口服细菌是使用口服稀释的，4周后，收集颊静脉，作为麻醉药物（Domitol 0.15ml/dolml/dolmim/dolmic liml/betfun/doctture n.8ml/doctture n.8ml/doctture n.8ml/betfu f. BW）腹膜内施用，以收集心血，然后通过宫颈脱位进行安乐死，并收集肝脏，肠道和粪便。下一代测序仪扩增子分析用于检查小鼠粪便的肠道菌群以及肝组织是否已经发展，严重，以及使用苏氧化元和azan肿瘤的肝炎发育或脱离或减少。将来，我们将使用AIH小鼠模型中使用FITC-脱滴液评估肠道通透性。我们将从AIH小鼠模型中去除肠道和肝脏，并使用流式细胞仪和免疫染色分析TFH细胞的数量，侵袭程度和功能。