Search for the regulatory mechanism of mitochondria by microRNA and long noncoding RNAs

利用microRNA和长链非编码RNA寻找线粒体的调控机制

基本信息

批准号：
20K08266
负责人：
水野洋介
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Saitama Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでに、特定のミトコンドリア関連遺伝子をCRISPR/CASでノックアウトしたヒト線維芽細胞と、さらに別の複数のミトコンドリア関連遺伝子をRNA干渉法によりノックダウンしたヒト線維芽細胞を用いた実験を行ってきた。ミトコンドリアの分裂や融合、エネルギー産生能やストレス制御に関わるDNM1L、MFN2、p32等の遺伝子の機能が欠損・抑制された細胞では、ミトコンドリアの伸展、分裂、融合等の形態変化やエネルギー産生能の低下を生じる。こうした細胞ではミトコンドリア機能に関わる非コードRNAの発現量にも大きな変化が生じていると考えられる。このような非コードRNAを同定するため、ヒト培養細胞を用いてDNM1L, MFN2,p32遺伝子をRNA干渉法によりノックダウン、またCRISPRシステムによりノックアウトした細胞からミトコンドリアおよびミトコンドリア内膜内成分（マイトプラスト）を分画して全RNAを抽出した。ミトコンドリア関連遺伝子を抑制させたことの効果として、ミトコンドリアの形態が変化していることを確認した。得られたミトコンドリアRNAについて発現アレイを用いてmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAの発現量を定量した結果、ミトコンドリア関連遺伝子の機能を抑制させた場合に、その影響を受けて発現量が変化したミトコンドリアmRNA、長鎖非コードRNA、マイクロRNAを検出することが出来た。ミトコンドリアの分裂や融合に関わる遺伝子を抑制することにより、共通して発現が変動する長鎖非コードRNAやマイクロRNAも複数検出することが出来た。この中に、ミトコンドリア機能を制御したり影響を及ぼし、ひいてはミトコンドリア病の発症要因にもなるRNAが含まれていると考えられるため、引き続き検証実験を実施している。

到目前为止，我们已经使用 CRISPR/CAS 敲除特定线粒体相关基因的人类成纤维细胞和使用 RNA 干扰敲除多个线粒体相关基因的人类成纤维细胞进行了实验。在涉及线粒体裂变和融合、能量产生能力和应激控制的基因（例如DNM1L、MFN2和p32）功能被删除或抑制的细胞中，线粒体伸长、裂变和融合等形态变化，并且发生能量生产能力下降。在这些细胞中，参与线粒体功能的非编码 RNA 的表达水平被认为发生了巨大的变化。为了鉴定此类非编码RNA，我们使用人类培养细胞，通过RNA干扰敲除DNM1L、MFN2和p32基因，并使用CRISPR从敲除细胞中提取线粒体和线粒体内膜成分（线粒体）分离系统并提取总RNA。我们证实线粒体的形态变化是抑制线粒体相关基因的结果。使用表达阵列对获得的线粒体RNA的mRNA、长链非编码RNA和微小RNA的表达水平进行定量，结果发现，当线粒体相关基因的功能受到抑制时，表达水平会发生变化我们能够检测线粒体 mRNA、长链非编码 RNA 和 microRNA。通过抑制参与线粒体裂变和融合的基因，我们能够检测到多种表达通常波动的长链非编码 RNA 和 microRNA。我们正在继续进行验证实验，因为这被认为含有控制或影响线粒体功能的RNA，甚至可能是线粒体疾病发病的一个因素。