抑制性シナプス後部の分子構成解明と特定の抑制性シナプス操作技術の開発

阐明抑制性突触后的分子组成并开发特定的抑制性突触操纵技术

• 批准号: 21K06377
• 负责人: 山崎 世和
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06377/
• 关键词: 抑制性シナプス; アデノ随伴ウイルス; シナプス伝達; シナプス分子構成

脳には様々な種類の抑制性神経細胞が存在するが、それぞれのシナプスに集積する分子の構成は明らかになっていない。本研究では、様々な分類が存在する抑制性シナプスのシナプス後部において、「どの抑制性シナプスにどの分子が局在しているのか？」という学術的問いを明らかにし、さらにそれらの分子を人為的に操作することによって、特定の抑制性シナプスを得意的に操作する技術を開発することを目的としている。三年間の研究期間の二年目である本年度は、初年度で検討したAAVを用いた遺伝子導入方を活用し、脳内への目的遺伝子の発現系確立に焦点を当てて研究を遂行した。本研究では、大脳皮質錐体細胞における抑制性シナプス後部分子を精製・同定するため、近接依存性ビオチン化標識酵素TurboIDにALFAタグ・膜貫通ドメインを導入したタンパク質(labeling module)を錐体細胞へ、さらにこのタンパク質を特定の抑制性シナプスへ局在させるためのGPIアンカーを融合した抗ALFAナノボディ（targeting module）を抑制性神経細胞へ、発現させる。初めに、抑制性シナプス全般をラベルできるか検討するために、SynプロモーターとmiRNAの標的配列を組み合わせた抑制性神経細胞特異的AAVベクターにlabeling moduleを組み込んだ。また、labeling moduleはCaMKIIプロモーターの下流に組み込んだ。これらのAAVを血液脳関門透過型のCapsidで作成し、大脳皮質に直接AAVを打ち込みWestern blottingと免疫染色をしたところ、Targeting module、Labeling moduleのどちらも、発現していることが確認された。

大脑中有多种类型的抑制性神经元，但每个突触处积累的分子组成尚不清楚。在这项研究中，我们澄清了抑制性突触的突触后区域中“哪些分子定位于哪些抑制性突触？”的学术问题，并进一步研究了哪些分子定位于哪些抑制性突触的问题该项目的目的是开发一种通过操纵特定抑制性突触来专门操纵它们的技术。今年是三年研究期的第二年，重点是利用第一年研究的基于 AAV 的基因转移方法，建立大脑中目标基因的表达系统。在本研究中，为了纯化和鉴定大脑皮层锥体细胞中的抑制性突触后分子，我们引入了一种蛋白质（标记模块），其中在邻近依赖性生物素化标记酶TurboID中引入了ALFA标签和跨膜结构域。此外，抗 ALFA 纳米抗体（靶向模块）与 GPI 锚融合，将该蛋白定位于特定的抑制性突触，并在抑制性神经元中表达。首先，为了检查抑制性突触是否可以被标记，将标记模块整合到结合了 Syn 启动子和 miRNA 靶序列的抑制性神经元特异性 AAV 载体中。此外，标记模块集成在 CaMKII 启动子的下游。当这些AAV与血脑屏障可渗透的衣壳一起构建并直接植入大脑皮层并进行蛋白质印迹和免疫染色时，证实靶向模块和标记模块均被表达。