大規模並列レポーターアッセイ法による転移因子進化メカニズムの解明

使用大规模并行报告基因检测阐明转座元件进化机制

基本信息

批准号：
21K06119
负责人：
井上詞貴
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K06119/
关键词：
エンハンサー転移因子 MPRA ゲノム進化エピゲノム iPS細胞神経前駆細胞

项目摘要

本研究では、転移因子機能の進化を明らかとするため、大規模並列レポーターアッセイ法（lentiMPRA）を用い、iPS細胞、神経前駆細胞における転移因子のエンハンサー活性を大規模並列的に解析する。先行研究で行ったエピゲノム解析から、MER11、MER34、MER52が iPS細胞および神経前駆細胞においてエンハンサー活性を持つと予想されたため、これらの転移因子ファミリーのバリアント合計約17,000配列を含むMPRAライブラリを作製した。これをヒトiPS細胞および神経前駆細胞へ導入し、細胞から回収したDNAおよびRNAバーコードについてNextSeqによるシークエンシングを行った。バイオインフォマティクス解析パイプライン（MPRAflowおよびMPRAnalyze）を用い、DNAおよびRNAバーコードを定量した。3実験群で高度に再現性があること、ポジティブコントロール配列、ネガティブコントロール配列が予想通りの挙動であること、既知のエピジェネティック修飾と相関があることを確認した。MER11の多くがiPS細胞において特異的に高いエンハンサー活性を持つことを見出した。従って、MER11サブファミリーの詳細な系統樹を作成し、その分岐とエンハンサー活性の獲得・消失の関連を解析した。

在本研究中，我们将使用大规模并行报告基因测定（lentiMPRA）以大规模并行方式分析iPS细胞和神经祖细胞中转座元件的增强子活性，以阐明转座元件功能的进化。根据之前研究进行的表观基因组分析，预测MER11、MER34和MER52在iPS细胞和神经祖细胞中具有增强子活性，因此我们创建了一个包含这些转座元件家族总共约17,000个变异序列的MPRA文库。将其引入人类 iPS 细胞和神经祖细胞中，并使用 NextSeq 对从细胞中回收的 DNA 和 RNA 条形码进行测序。使用生物信息学分析管道（MPRAflow 和 MPRAnalyze）对 DNA 和 RNA 条形码进行定量。我们证实，三个实验组的结果具有高度可重复性，阳性和阴性对照序列的行为符合预期，并且与已知的表观遗传修饰存在相关性。我们发现大多数 MER11 具有高增强子活性，特别是在 iPS 细胞中。因此，我们创建了MER11亚家族详细的系统发育树，并分析了其分歧与增强子活性的获得/丧失之间的关系。