カルシウムポンプの調節メカニズムの構造学的解明

钙泵调节机制的结构阐明

基本信息

批准号：
21K06062
负责人：
椛島佳樹
金额：
$ 2.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では心筋における調節ペプチドであるphospholamban（PLN）による筋小胞体Ca2+ポンプの活性調節メカニズムの理解を目的としている。令和4年度は、前年度に引き続き、①COS細胞-アデノウイルス蛋白質発現系を用いたSERCA-PLN融合蛋白質の大量生産系の構築、②クライオ電顕を用いた原子構造決定のための試料作製条件の最適化を行うとともに、新たに、③浮遊293細胞-BacMamウイルス蛋白質発現系を用いたSERCA-PLN融合蛋白質の大量生産系の構築を行った。①前年度までに作成した20個のGly残基から成るリンカーによりSERCAとPLNを遺伝子工学的に連結した融合蛋白質の発現用コンストラクトを用いてアデノウイルスを作製した。さらに、疑似燐酸化変異を導入した融合蛋白質（S16E変異体）の発現用アデノウイルスも作製し、これらのウイルスをCOS7細胞に感染させ小スケールの発現チェックを行った。その結果、構造解析に十分な量の発現が観察されたため、ウイルスの大量調製を行い、高力価のアデノウイルスを得た。②クライオ電顕を用いた単粒子解析による構造決定を目指し、ウサギ骨格筋より精製したSERCAのナノディスク化条件を検討した。膜骨格蛋白質としてはMSP1D1を用いて界面活性剤の種類、界面活性剤の除去方法（時間、温度など）、ゲルろ過条件などを検討し、電顕観察に適したナノディスク化及び観察用グリッド作製条件を最適化することができた。③浮遊293細胞-BacMamウイルス系を用いたSERCA-PLN融合蛋白質の発現系構築を検討した。融合蛋白質の遺伝子を導入したバクミドを作製し、ウイルス調製条件を検討したところ高力価のウイルスを作製することに成功した。蛋白質発現時の培地の種類や添加剤などを検討することにより、クライオ電顕解析に適用可能な量のタンパク質を得ることができた。

本研究的目的是了解心肌中调节肽受磷蛋白（PLN）调节肌浆网Ca2+泵活性的机制。 2020财年，继上一年的基础上，我们将（1）使用COS细胞-腺病毒蛋白表达系统构建SERCA-PLN融合蛋白的量产系统，以及（2）使用冷冻电子进行原子结构测定的样品制备条件除了优化方法外，我们还利用浮动293细胞-BacMam病毒蛋白表达系统构建了SERCA-PLN融合蛋白的新批量生产系统。 ① 腺病毒是使用去年制作的表达融合蛋白的构建体制作的，其中SERCA和PLN通过由20个Gly残基组成的连接子进行基因连接。此外，我们创建了用于表达引入了假磷酸化突变的融合蛋白（S16E突变体）的腺病毒，并通过用这些病毒感染COS7细胞来进行小规模表达检查。结果，观察到足够量的表达用于结构分析，因此制备了大量的病毒并获得了高滴度的腺病毒。 ② 我们研究了从兔骨骼肌中纯化的 SERCA 的纳米盘形成条件，目的是使用冷冻电镜通过单粒子分析确定其结构。作为膜骨架蛋白，我们利用MSP1D1研究了表面活性剂的类型、表面活性剂去除方法（时间、温度等）、凝胶过滤条件等，并创建了适合电子显微镜和观察网格的纳米盘。优化条件。 ③我们研究了利用浮动293细胞-BacMam病毒系统构建SERCA-PLN融合蛋白表达系统。在创建含有融合蛋白基因的杆粒并检查病毒制备条件后，我们成功创建了高滴度病毒。通过检查蛋白质表达过程中使用的培养基和添加剂的类型，我们能够获得适用于冷冻电镜分析的蛋白质量。