A novel regulatory mechanism of the function of tumor suppressor p27 by a nucleolar protein NPM1.

核仁蛋白 NPM1 调节肿瘤抑制因子 p27 功能的新机制。

基本信息

批准号：
21K05510
负责人：
千葉櫻拓
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

NPM1によるp27機能抑圧機構：前年度にNPM1のp27相互作用部位として３箇所のアミノ酸残基が示唆されたため、当該箇所の置換変異体とp27との動物細胞内相互作用を免疫沈降法により解析した結果、内在性NPM1発現下では外来性NPM1-p27相互作用が検出されず、内在性NPM1発現抑制下で変異体の相互作用低下が示された。NPM1は細胞内の液-液相分離に関与することから、p27との相互作用も液-液相分離を介しており、細胞破砕液中では検出されにくいと考えられた。また、NPM1抑制因子ARFとp27機能との相関性を検証するため、ARF遺伝子の破壊および外来性導入を試みたが、前者はARF遺伝子領域の別遺伝子との重複、後者はARFの増殖抑制機能のため実現困難であった。p53によるp27安定化機構およびp27発現とがん細胞表現型との相関性：前年度より、p53欠損によるp27タンパク質分解の促進、足場非依存条件下でのp53依存的なp27によるがん細胞増殖抑制が示唆されたため、p27の新規制御機構として重要と考え、積極的に研究を推進した。まず、p53はp27のポリユビキチン化非依存・プロテアソーム依存的分解を抑制することが示唆された。次に、p27の10番目セリン残基（S10）または187番目スレオニン残基（T187）の非リン酸化型変異により、p53欠損下でのp27分解が抑圧された。S10およびT187のリン酸化は各々異なるポリユビキチン化経路を誘導するが、p53に抑制されるp27分解系はこれらと同じシグナルに依存する未知の機構であることが示唆された。p27とがん細胞表現型の相関については、創傷治癒アッセイにより遊走能を、トランスウェルアッセイにより浸潤能を検証した結果、両表現型ともp27の誘導発現により抑制された。また、マウスがん異種移植系においてp27の誘導発現により転移が抑制された。

NPM1抑制p27功能的机制：由于前一年有人提出NPM1中的三个氨基酸残基为p27相互作用位点，我们通过免疫沉淀分析了相关位点的取代突变体与p27之间的相互作用，结果没有发现。当内源性NPM1表达时，检测到外源性NPM1-p27相互作用，并且当内源性NPM1表达受到抑制时，突变体的相互作用减弱。由于 NPM1 参与细胞内液-液相分离，因此认为与 p27 的相互作用也是由液-液相分离介导的，并且在细胞裂解液中很难检测到。另外，为了验证NPM1抑制子ARF与p27功能之间的相关性，我们尝试破坏并外源导入ARF基因，但前者是由于ARF基因区域与另一个基因重复，而后者是由于ARF基因区域与另一个基因重复所致。因此，ARF的生长抑制功能很难实现。 p53 的 p27 稳定机制以及 p27 表达与癌细胞表型之间的相关性：从前一年开始，p53 缺陷促进 p27 蛋白降解，并且在不依赖锚定的条件下，p53 依赖性 p27 诱导癌细胞增殖。被抑制后，我们认为它作为 p27 的新控制机制很重要，并积极对其进行研究。首先，有人认为 p53 抑制 p27 的多聚泛素化依赖性和蛋白酶体依赖性降解。接下来，p27 第 10 个丝氨酸残基 (S10) 或第 187 个苏氨酸残基 (T187) 的非磷酸化突变抑制了 p53 缺陷下 p27 的降解。尽管 S10 和 T187 磷酸化各自诱导不同的多泛素化途径，但有人认为 p53 抑制的 p27 降解系统是依赖于这些相同信号的未知机制。关于p27和癌细胞表型之间的相关性，我们通过伤口愈合实验验证了迁移能力，并通过transwell实验验证了侵袭能力，并且这两种表型都被p27的诱导表达所抑制。此外，p27 的诱导表达抑制了小鼠癌症异种移植系统中的转移。