PCRによる1分子DNA検出性能の評価

PCR单分子DNA检测性能评价

基本信息

批准号：
21K05494
负责人：
高畠令王奈
金额：
$ 2.66万
依托单位：
National Agriculture and Food Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K05494/
关键词：
極低濃度 PCR 標準物質定量分析 1分子

项目摘要

一般的に、PCRは、僅か１分子のDNAをも検出可能であると考えられてるが、そのような検証は未だなされていない。本研究では、PCRの標的配列を１個単位で制御可能な標準物質を作製、利用し、DNA1分子に対する検出性能の評価を目的としている。1コピーの検出性能を正確に評価するには、確実に標的配列を１コピー含む標準物質の存在が不可欠である。本研究では、当初、このような標準物質として細胞を用いる手法を検討していたが、標準細胞をインクジェットで分注する技術の利用が困難になってしまったため、別のアプローチを試みることとした。具体的には、高濃度のDNAを限界まで希釈する限界希釈法を利用することにした。手法としては、1コピーの標的配列と、それとは別の確認配列を同じDNA分子内に複数コピー導入し、標準DNAとする。このような標準DNAの溶液を限界まで希釈すると、DNAを含む溶液と含まない溶液に分かれ、DNAを含む溶液には、非常に高い確率で1分子のDNAが含まれるものと予想される。1コピーの標的配列が存在している希釈画分を得るために、各分注溶液について、確認配列を標的にPCRを行い、標準DNAの存在を確認する。これにより、細胞法と同等の検証が可能となる。今年度は、このような標準DNAのコンストラクションを行った。文献より、リアルタイムPCRでは、4コピー程度以上のDNAであれば検出可能である旨の報告があることから、確認配列を8コピー導入した標準DNAを作出した。

人们普遍认为PCR甚至能够检测一分子DNA，但这种验证尚未进行。在这项研究中，我们创建并使用了可以逐一控制 PCR 靶序列的标准材料，旨在评估单个 DNA 分子的检测性能。为了准确评估一份拷贝的检测性能，必须有一份明确包含一份目标序列的标准材料。在这项研究中，我们最初考虑了一种使用细胞作为标准材料的方法，但由于使用喷墨技术来分配标准细胞变得困难，我们决定尝试不同的方法。具体来说，他们决定使用有限稀释法，将高浓度的 DNA 稀释到极限。该方法涉及将目标序列的一个拷贝和单独的确认序列的多个拷贝引入到同一个DNA分子中，然后将其用作标准DNA。当这样的标准DNA溶液被稀释到极限时，它会分离成含有DNA的溶液和不含DNA的溶液，并且预计含有DNA的溶液将以非常高的概率含有一分子DNA。为了获得其中存在一个拷贝的靶序列的稀释级分，使用确认序列作为靶对各等分溶液进行PCR以确认标准DNA的存在。这使得验证等同于单元方法。今年，我们构建了这样一个标准DNA。文献中有报道称实时PCR可以检测大约4个拷贝或更多的DNA，因此我们创建了一个标准DNA，其中引入了8个拷贝的确认序列。