コリネ型細菌のビオチン排出輸送体の同定と発酵への応用

棒状杆菌生物素外排转运蛋白的鉴定及其在发酵中的应用

基本信息

批准号：
21K05337
负责人：
池田正人
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Shinshu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

【BioE欠損候補株の選抜法】想定される未同定のビオチン排出輸送体（BioEと命名）の欠損候補株を選抜するための構想は以下の通り。コリネ型ビオチン生産菌はビオチン取り込み輸送体BioYを破壊すると、ビオチンを自ら合成できるのにビオチン要求性となる。このBioY破壊株（DD1株と命名）から再びビオチン非要求性になったサプレッサー株を選抜する。BioE欠損株に想定される表現型は次の3点。① 生育にビオチンを要求しない　② ビオチンを分泌しないか分泌量が低下している　③ 細胞内に高濃度のビオチンが蓄積している。【BioE欠損候補株の取得】DD1株から変異処理にて上記3要件を満たす候補株を1株（#499株）見出した。全ゲノム解析で#499株に計80個の変異を見出す。その内、以下の4変異を有力候補として選抜。① Cgl0406：[Pro822Ser] ABC transporter, permease component　② Cgl0859：[Ala307Val] Hypothetical membrane protein　③ Cgl0946：[Gly88Asp] ABC transporter, ATPase component　④ Cgl2657：[Gly70Asp] Transcriptional regulator, Cgl2656 (LysE-type translocator)のActivator【相補試験】上記4種の野生型遺伝子をクローン化。各プラスミドを#499株に導入し相補試験を実施。もし目的遺伝子であれば、親株#499株の表現型（ビオチン要求性）に戻るはずであるが、いずれも回復能を示さなかった。従って、いずれも目的遺伝子ではないと判断された。原因変異を抽出する段階で目的変異を見逃している可能性があるため、今後は自然変異によって目的候補株の取得を試みる。

[选择BioE缺失的候选菌株的方法] 选择假定的未鉴定的生物素流出转运蛋白(称为BioE)缺失的候选菌株的概念如下。当产生棒状生物素的细菌破坏生物素摄取转运蛋白BioY时，即使它们本身可以合成生物素，它们也会变得需要生物素。从该 BioY 破坏的菌株（称为 DD1 菌株）中，选择再次需要生物素的抑制菌株。 BioE 缺陷菌株预计会出现以下三种表型。 ① 生长不需要生物素 ② 不分泌生物素或分泌量减少 ③ 细胞内积累高浓度的生物素。【BioE缺陷候选菌株的获得】我们通过DD1菌株的突变处理，找到了满足上述三个要求的候选菌株（菌株#499）。通过全基因组分析，#499 菌株共发现 80 个突变。其中，以下四种突变被选为潜在候选突变。 ① Cgl0406：[Pro822Ser] ABC 转运蛋白、通透酶成分 ② Cgl0859：[Ala307Val] 假想膜蛋白 ③ Cgl0946：[Gly88Asp] ABC 转运蛋白、ATPase 成分 ④ Cgl2657：[Gly70Asp] 转录调节因子、 Cgl2656激活子(LysE型易位子) [互补试验] 克隆上述4个野生型基因。将每个质粒引入菌株#499并进行互补测试。如果它是目标基因，它应该恢复到亲本菌株#499的表型（生物素营养缺陷型），但没有一个显示出恢复能力。因此，确定它们都不是目标基因。由于在致病突变提取阶段有可能遗漏目标突变，今后我们将尝试通过自然突变来获取目标候选菌株。