Research for identification of rubber-decomposing gene which is included in rubber-decomposing bacteria

橡胶分解菌中橡胶分解基因的鉴定研究

基本信息

批准号：
21K04329
负责人：
笈木宏和
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Kurume National College of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ゴム分解微生物(Enterobacter MOE-1株、以下MOE-1株と記す)の変異体作製によるゴム分解遺伝子部位の同定、遺伝子組み換えによる機能特定と改良、およびそれを基にした低温でかつ安全に利用することのできる合成ゴム分解バイオリアクターの作製を行うための検討を行う。今年度は昨年度に引き続き、ゴム分解能力喪失変異体の作製を試みた。紫外線を用いてゴム分解微生物にランダムな変異を起こし、得られた複数個の変異体群から、アルデヒドの生成能力の欠落した株を選別していった。ゴム分解能喪失の有無は、昨年度報告したプレート法を用いた。これにより、想定よりも早く変異体の選別が可能となった。前年度と合わせて、おおよそ1万個のコロニーの分析を行ったが、ゴム分解能欠損株を発見することはできなかった。今年度もコロナの影響により実験が制限されたことも原因として挙げられるが、変異体作成による手法は効率が悪いことから、昨年度後半より、ゴムを分解する酵素のアミノ酸配列による遺伝子部位同定についても並行して実施している。前年度で報告した通り、最終年度実施予定のゴム分解変異体の大量培養をバッチ式で行うためのリアクター作製を前倒しして平衡実施した。今年度は予備試験として、分解率が向上するための予備試験として、フラスコを用いた小型培養装置による各種条件の振り分けを行った。これより、酸素濃度や培地組成を調整することにより、従来の5～7倍程度の分解率を得ることに成功した。また、各種培養条件でデータをもとに、SVMによるSBR分解率予測モデルの構築を行ったところ、ほとんどの予測モデルにおいて0.7前後の精度を得た。この条件をもとに市販のステンレス容器を加工し、ゴムの分解をバッチ式で行う大型リアクターの構築を行った。次年度、小型装置で得られた結果も参考にしながら、分解条件の検討を行う予定である。

在本研究中，我们将通过创建橡胶降解微生物（肠杆菌MOE-1菌株，以下简称MOE-1菌株）的突变体来鉴定橡胶降解基因位点，通过基因重组来鉴定和完善其功能，并在此基础上，我们将开发一种低温下的橡胶降解基因，我们还将进行研究，以创建一种可以安全使用的合成橡胶分解生物反应器。今年，继去年之后，我们试图创造一种失去降解橡胶能力的突变体。他们利用紫外线诱导橡胶降解微生物发生随机突变，并从产生的突变体群体中选择了缺乏产生醛的能力的菌株。去年报道的平板法用于确定橡胶分辨率是否损失。这使得比预期更快地选择突变体成为可能。包括去年在内，我们分析了大约10,000个菌落，但我们无法找到任何缺乏橡胶分解能力的菌株。原因之一是实验因冠状病毒的影响而受到限制，但由于创建突变体的方法效率低下，从去年下半年开始，我们开始利用氨基酸来鉴定基因位点降解橡胶的酶的顺序它们是并行进行的。正如去年报道的那样，原定于最后一年进行的橡胶降解突变体分批培养反应器的准备工作提前并在平衡状态下进行。今年，作为提高分解率的初步试验，我们使用使用烧瓶的小型培养装置进行了各种条件。通过调整氧气浓度和介质成分，他们成功实现了比传统方法高五到七倍的分解率。此外，当我们基于各种培养条件下的数据使用SVM构建SBR降解率预测模型时，大多数预测模型的准确度在0.7左右。基于这些条件，我们制造了一个市售的不锈钢容器，并建造了一个用于间歇式橡胶分解的大型反应器。明年，我们计划研究分解条件，同时参考小型设备获得的结果。