心筋組織において運動が及ぼす解糖系酵素GAPDHのニトロ化シグナルへの影響

运动对心肌组织糖酵解酶GAPDH硝化信号的影响

基本信息

批准号：
21K11397
负责人：
馬場猛
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K11397/
关键词：
インスリン翻訳後修飾 2型糖尿病心筋シグナル伝達

项目摘要

血糖値制御システムの破綻による糖尿病の発症が、脳卒中や心臓病などの病態を誘発する主要因の一つであり、血糖値調節機構を解明することが非常に重要だと考えられる。これまでの本研究によって、ラット心筋由来のH9c2細胞株では、インスリン刺激依存的に解糖系酵素GAPDHがリン酸化修飾されるに先だってトリプトファンがニトロ化修飾され、酵素活性の亢進が引き起こされることを見出してきた。さらにこのニトロ化修飾は速やかに脱ニトロ化されていく。ニトロ化・脱ニトロ化に関与する分子の探索を行うために、EGFP融合－野生型GAPDHあるいはEGFP融合－変異型GAPDH(トリプトファンをフェニルアラニンに置換：Trp/Phe)を安定的に発現するように樹立したH9c2変異体細胞株に対してインスリン刺激し、各細胞溶解液を抗EGFP抗体を用いた免疫沈降後、電気泳動し、インスリン刺激後のEGFP融合－野生型GAPDHに強く結合していた分子量約40kDaの分子に着目した。プロテオーム解析による同定によって、この分子がH9c2細胞株にもともと内在しているGAPDHであることが明らかとなった。また、抗ニトロトリプトファン抗体および抗GAPDH抗体によるウエスタンブロットの結果からもEGFP融合－野生型GAPDHがインスリン刺激後、ニトロ化され、ニトロ化に伴って内在のGAPDHと会合することが確認された一方で、EGFP融合－変異型GAPDH(Trp/Phe)ではインスリン刺激に伴うニトロ化修飾および内在のGAPDHとの会合は検出されなかった。解糖系の反応の場はサイトゾルであり、GAPDHはサイトゾルで四量体を形成して解糖系酵素として機能することが知られているが、本研究によって得られた知見により、トリプトファンのニトロ化修飾が四量体形成にかかわっている可能性が示唆された。

由血糖控制系统失败引起的糖尿病的发作是诱导病理（例如中风和心脏病）的主要因素之一，阐明澄清血糖调节机制非常重要。这项研究表明，在源自大鼠心肌的H9C2细胞系中，色氨酸是硝化的，并且在以依赖性方式胰岛素刺激的方式磷酸化糖酵解酶GAPDH之前引起了酶活性。此外，这种硝化修饰被迅速陈述。为了搜索参与硝化和结的分子，我们在建立的H9C2突变细胞系上刺激胰岛素，以稳定表达EGFP EGFP融合型伴侣GAPDH或EGFP融合 - 突变体GAPDH（TRP/PHE）（TRP/PHE），并使用Antopipipipity inthat Antibote ant Antibore ant Antyprofe and Anti-Egfp，并使用Ant-EgfP进行了抗衡。胰岛素刺激后，分子量约为40 kDa，与EGFP融合型GAPDH强烈结合。通过蛋白质组学分析识别表明，该分子是GAPDH，最初是H9C2细胞系固有的。 Furthermore, Western blotting with anti-nitrotryptophan and anti-GAPDH antibodies confirmed that EGFP fusion-wild-type GAPDH was nitrated after insulin stimulation and associated with endogenous GAPDH with nitration, while EGFP fusion-mutated mutant GAPDH (Trp/Phe) did not detect any nitration modification associated with insulin stimulation或与内源性GAPDH相关。糖酵解反应的位点在细胞质中，已知GAPDH在细胞质中形成四聚体，并用作糖酵解酶。但是，从这项研究中获得的发现表明，色氨酸的硝化修饰可能与四聚体形成有关。