歯の再生を目指したヒト乳歯歯髄幹細胞濃縮と機能解析

人乳牙牙髓干细胞富集及牙齿再生功能分析

• 批准号: 21K10165
• 负责人: 稲田 絵美
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K10165/
• 关键词: 乳歯歯髄幹細胞; 細胞工学的手法; アルカリホスファターゼ; 多能性幹細胞

申請者らの過去の研究から「アルカリフォスファターゼ（ALP）高活性かつOCT-3/4陽性の細胞（以下、ALP(+)/OCT-3/4(+)と表記）は多能性幹細胞になり得る」と判断された。本研究では、細胞工学的手法によるHDDPC（ヒト乳歯由来歯髄細胞）由来ALP(+)/OCT-3/4(+)安定株樹立を目指す。同細胞の特性を解析する一方、マウス胎仔の歯槽堤部由来細胞との共培養による組織再構成実験を行い、当該細胞の機能性（多能性幹細胞の特性を有する細胞か否か）を明らかにする。2021年度では、限界希釈法でHDDPCをsingle cell化した後、増殖させる試みを行ったが、維持・増殖が進まない状況にあった。そこで、わずかに増殖した各細胞からmRNAを回収し、遺伝子発現解析が可能な全トランスクリプトーム増幅法（WTA）を用い、幹細胞特異的遺伝子の発現をRT-PCR法にて調べた。その結果、cell cloneによってはALP等の幹細胞特異的遺伝子の発現様式が異なることが判った。2022年度では、細胞の器官培養の適正条件について検討した。細胞増殖の足場となるscaffold にはvitroGel（TheWell）とMatrigel（Corning）を採用し、EGFP蛍光発現マウスB16 melanoma細胞を培養した。その結果、vitroGelではB16 melanoma細胞がscaffold周辺部に拡がったが、Matrigelではscaffold内部での増殖・拡大が認められたことから、Matrigel はin vitroでの細胞の3D構造構築に最適な素材ではないかと判断された。また、Matrigelを用いてiPS細胞からの三胚葉性分化細胞への分化誘導を検討したところ、その程度は低いものの分化誘導ができる可能性が示唆された。

申请人先前的研究确定“高度活性和OCT-3/4阳性的细胞（以下称为ALP（+）/Oct-3/4（+））可以成为多能干细胞。”在这项研究中，我们旨在通过使用细胞工程方法来建立稳定的ALP（+）/Oct-3/4（+）菌株，该菌株衍生自HDDPC（人乳牙衍生的纸浆细胞）。在分析同一细胞的特征时，组织重建实验是通过源自小鼠胎儿肺泡脊而衍生的细胞进行的，并且细胞的功能（是否具有多能干细胞的特性）。在2021年，我们使用极限稀释方法将其转化为单个细胞后，试图生长HDDPC，但维持和增殖没有进展。因此，从每个生长略有生长的细胞中收集mRNA，并使用完整的转录组放大方法（WTA）通过RT-PCR检查干细胞特异性基因的表达，该方法允许基因表达分析。结果，发现干细胞特异性基因（例如ALP）的表达模式取决于细胞克隆。在2022年，我们检查了细胞器官培养的适当条件。使用玻璃体（井）和基质（康宁）作为细胞增殖的支架，并培养表达EGFP的小鼠B16黑色素瘤细胞。结果，B16黑色素瘤细胞扩散到玻璃体中支架的外围，但发现Matrigel在支架内部增殖并膨胀，因此确定Matrigel是在体外构建3D结构的最佳材料。此外，当我们使用Matrigel研究了从IPS细胞分化为三角分化细胞中的分化时，建议可以诱导分化，尽管它的程度很低。

项目成果

Electroporation-Based Non-Viral Gene Delivery to Adipose Tissue in Mice

基于电穿孔的非病毒基因递送至小鼠脂肪组织

• DOI: 10.21926/obm.genet.2202151
• 发表时间: 2022
• 期刊: OBM Genetics
• 作者: Masahiro Sato;Issei Saitoh;Yuki Kiyokawa;Eri Akasaka;Shingo Nakamura;Satoshi Watanabe;Emi Inada
• 通讯作者: Emi Inada

Recent advances in in vivo genome editing targeting mammalian preimplantation embryos.

针对哺乳动物植入前胚胎的体内基因组编辑的最新进展。

• DOI: 10.5772/intechopen.106873
• 发表时间: 2023
• 期刊: InTechOpen
• 作者: Sato M;Ohtsuka M;Inada E;Nakamura S;Saitoh I;Takabayashi S
• 通讯作者: Takabayashi S

Cytoplasmic microinjection of piggyBac transposase mRNA and transposon vectors for efficient in vitro production of transgenic porcine parthenotes.

PiggyBac 转座酶 mRNA 和转座子载体的细胞质显微注射可有效体外生产转基因猪单性动物。

• DOI: 10.21926/obm.genet.2203166
• 发表时间: 2022
• 期刊: OBM Genetics
• 作者: Miyagasako R;Hansol J;Watanabe S;Miyoshi K;Inada E;Sato M
• 通讯作者: Sato M

The Role of Genetically Modified Human Feeder Cells in Maintaining the Integrity of Primary Cultured Human Deciduous Dental Pulp Cells.

• DOI: 10.3390/jcm11206087
• 发表时间: 2022-10-15
• 期刊: Journal of clinical medicine
• 影响因子: 3.9
• 作者: Ibano N;Inada E;Otake S;Kiyokawa Y;Sakata K;Sato M;Kubota N;Noguchi H;Iwase Y;Murakami T;Sawami T;Kakihara Y;Maeda T;Terunuma M;Terao Y;Saitoh I
• 通讯作者: Saitoh I

Development of a novel, pipette tip-aided cell cloning method for effective isolation of genome-edited porcine cell

开发一种新型移液器吸头辅助细胞克隆方法，用于有效分离基因组编辑的猪细胞

• DOI: 10.21926/obm.genet.2101126
• 发表时间: 2020
• 期刊: OBM Genetics
• 作者: Sato M;Saitoh I;Akasaka E;Inada E
• 通讯作者: Inada E