Development of heme proteins capturing artificial metal complexes for its applications

开发捕获人造金属复合物的血红素蛋白及其应用

• 批准号: 21J15614
• 负责人: 榊原 えりか
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-28 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J15614/
• 关键词: ヘム蛋白質; 合成金属錯体; ポルフィリン; バイオ触媒

合成金属錯体としてテトラフェニルポルフィリン錯体（TPP錯体）を捕捉させたヘム蛋白質HasA（TPP-HasA）を用いて、位置立体選択的な触媒反応の実現を試みた。HasAの錯体結合部位の近傍に位置するバリン残基に変異導入すると、結晶構造中で基質の配位サイトが確保された状態でTPP錯体を捕捉可能であることが明らかとなった。そこで、TPP-HasA変異体の結晶をそのまま触媒として用いたスチレンのシクロプロパン化反応を実施したものの、エナンチオ選択性は発現しなかった。この変異体の反応空間は、基質の配向を制御するためには広すぎるために選択性が発現しなかったと予想し、リシン残基への追加の変異導入を行ったところ、最大16% eeのエナンチオ選択性でスチレンのシクロプロパン化反応に成功した。X線結晶構造解析から、新たに設計したTPP-HasAの変異体は、よりタイトなパッキング構造をとっていることが明らかとなり、反応空間の制御が選択性の向上に寄与したことを支持する結果を得た。また、他の研究室との共同研究として、ヘテロ原子を骨格に含むポルフィリン錯体（オキサポルフィリンコバルト錯体）を捕捉したHasAが緑膿菌の増殖を効果的に抑制することを明らかにした。ポルフィリンの骨格と緑膿菌の増殖抑制効果の関係性を明らかにすべく、各種測定にも意欲的に取り組んだ。さらに、緑膿菌のヘム獲得機構を逆手に取った殺菌手法の開発に向けた一歩として、緑膿菌の内膜ヘムトランスポーター（PhuUV）の発現も試みた。当研究室で一般的に用いているバクテリアを宿主とした発現系では、PhuUVの発現は確認できなかったため、コムギ由来の無細胞発現系の利用をしたところ、PhuUVの発現に成功した。相互作用解析によって、無細胞発現系で発現したPhuUVが複合体を形成していることを強く示唆する結果も得た。

我们尝试使用血红素蛋白 HasA (TPP-HasA) 实现区域立体选择性催化反应，其中四苯基卟啉复合物 (TPP 复合物) 被捕获为合成金属复合物。结果表明，位于 HasA 复合物结合位点附近的缬氨酸残基的诱变使得捕获 TPP 复合物成为可能，同时确保晶体结构中的底物配位位点。因此，我们使用TPP-HasA突变晶体作为催化剂进行了苯乙烯的环丙烷化反应，但没有观察到对映选择性。我们预测该突变体的反应空间太宽，无法控制底物方向，因此不表现出选择性，因此我们在赖氨酸残基上引入了额外的突变，从而产生了最大 16% ee 的苯乙烯对映选择性环丙烷化反应。成功实现了。 X 射线晶体分析表明，新设计的 TPP-HasA 突变体具有更紧密的堆积结构，这支持了反应空间的控制有助于提高选择性。此外，在与其他实验室的联合研究中，我们发现HasA捕获了骨架中含有杂原子的卟啉复合物（氧卟啉钴复合物），可有效抑制铜绿假单胞菌的生长。为了阐明卟啉骨架与其抑制铜绿假单胞菌生长作用之间的关系，我们热情地开展了各种测量。此外，作为开发利用铜绿假单胞菌血红素获取机制的灭菌方法的一步，我们还尝试表达铜绿假单胞菌内膜血红素转运蛋白（PhuUV）。由于我们无法使用我们实验室常用的基于细菌的表达系统来确认 PhuUV 的表达，因此我们使用源自小麦的无细胞表达系统成功地表达了 PhuUV。通过相互作用分析，我们还获得了强烈表明在无细胞表达系统中表达的 PhuUV 形成复合物的结果。

项目成果

Tetraphenylporphyrin Enters the Ring: First Example of a Complex between Highly Bulky Porphyrins and a Protein**

四苯基卟啉进入环：高体积卟啉和蛋白质之间的复合物的第一个例子**

• DOI: 10.1002/cbic.202200095
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 3.2
• 作者: Shisaka Yuma;Sakakibara Erika;Suzuki Kazuto;Stanfield Joshua Kyle;Onoda Hiroki;Ueda Garyo;Hatano Miu;Sugimoto Hiroshi;Shoji Osami
• 通讯作者: Shoji Osami

Tetraphenylporphyrin Enters the Ring: First Example of a Complex between Highly Bulky Porphyrins and a Protein**

四苯基卟啉进入环：高体积卟啉和蛋白质之间的复合物的第一个例子**

• DOI: 10.1002/cbic.202200095
• 发表时间: 2022
• 影响因子: 3.2
• 作者: Shisaka Yuma;Sakakibara Erika;Suzuki Kazuto;Stanfield Joshua Kyle;Onoda Hiroki;Ueda Garyo;Hatano Miu;Sugimoto Hiroshi;Shoji Osami
• 通讯作者: Shoji Osami

A Heme‐Acquisition Protein Reconstructed with a Cobalt 5‐Oxaporphyrinium Cation and Its Growth‐Inhibition Activity Toward Multidrug‐Resistant Pseudomonas aeruginosa

用 5-氧代卟啉钴阳离子重建的血红素获取蛋白及其对多重耐药铜绿假单胞菌的生长抑制活性

• DOI: 10.1002/anie.202112456
• 发表时间: 2022
• 作者: Takiguchi Asahi;Sakakibara Erika;Sugimoto Hiroshi;Shoji Osami;Shinokubo Hiroshi
• 通讯作者: Shinokubo Hiroshi

A Heme‐Acquisition Protein Reconstructed with a Cobalt 5‐Oxaporphyrinium Cation and Its Growth‐Inhibition Activity Toward Multidrug‐Resistant Pseudomonas aeruginosa

用 5-氧代卟啉钴阳离子重建的血红素获取蛋白及其对多重耐药铜绿假单胞菌的生长抑制活性

• DOI: 10.1002/anie.202112456
• 发表时间: 2022
• 作者: Takiguchi Asahi;Sakakibara Erika;Sugimoto Hiroshi;Shoji Osami;Shinokubo Hiroshi
• 通讯作者: Shinokubo Hiroshi