肝細胞がん多段階発がんにおけるWNTパスウェイ活性化メカニズムの解明

阐明肝细胞癌多步癌变过程中WNT通路激活机制

• 批准号: 21K08807
• 负责人: 緑川 泰
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Center of Neurology and Psychiatry
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08807/
• 关键词: 肝細胞癌; WNTパスウェイ; ベータカテニン; E-カドヘリン; 細胞悪性度; 多段階発がん; 次世代シーケンサー

昨年度までに行ったシーケンスによる8種類の肝がん細胞株についてベータカテニンの遺伝子異常については以下の通りである。ベータカテニンmut:HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, HLEベータカテニンWT: Huh7, SH-Hep1CDH1を強制発現させるために現在まで以下の実験を遂行している。すなわちCDH1の転写領域全長（2,807bp）をpCDH-EF1-T2A-Puro（レンチウィルスベクター）にサブクローニングした。さらに上記のベータカテニンmut の各細胞株にトランスフェクションすることによりE-カドヘリンの発現を誘導し、48時間後に免疫染色によりE-カドヘリンの細胞膜への局在でトランスフェクションの効率については判定した。CDH1発現によるベータカテニンの核への移行の影響についても、免疫染色によりトランスフェクション前後の細胞株を比較検討を行い、高い高率でトランスフェクションが行われていることを確認した。CTNNB1 mut過剰発現についてもベータカテニンmutを有する細胞株HepG2よりCTNNB1の全長（3,488bp）をサブクローニングした後、トランスフェクションは上記の方法でベータカテニンWT細胞株に行った。さらにこれらのDNA導入した細胞株についてsiRNAによりCDH1をノックダウンすることによりカテニンの核への移行を確認する予定である。上記で作成した肝がん細胞について、今年度中にRNAシーケンスによりWNT下流遺伝子の発現レベルの 化、WNTパスウェイの活性化を確認する予定である。さらに、上記で作成した細胞株についてそれぞれカドヘリン発現の有無で細胞 殖能、細胞遊走能、細胞浸潤能などを比較し、肝がん細胞の 性化について比較検討する予定である。

以下是Betacatenin对八种类型的肝癌细胞系的基因异常，该肝癌细胞系由直到去年进行的序列进行。迄今为止，已经进行了以下实验，以迫使β-catenin mut的表达：hepg2，hepg2，hep3b，plc/prf/5，hle beta-catenin wt：huh7，sh-hep1cdh1。也就是说，将CDH1的整个转录区域长度（2,807 bp）取代到PCDH-EF1-T2A-PURO（慢病毒载体）中。此外，通过将β-catenin mut的每条细胞系转染在上面的每个细胞系中诱导E-钙粘蛋白的表达，并且在48小时后，转染的效率是通过通过免疫染色将E-钙粘着蛋白定位到细胞膜来确定的。关于CDH1对核对细胞核的表达的影响，通过免疫染色比较转染前后的细胞系，并且可以证实转染以高速率进行。对于CTNNB1 mut过表达，将CTNNB1的全长（3,488 bp）用betacatenin mut从细胞系HEPG2亚克隆，然后使用上述方法在betacatenin wt细胞系中进行转染。此外，我们计划通过用siRNA将CDH1击倒这些DNA转导的细胞系，以确认链球菌对细胞核的易位。对于上面创建的肝癌细胞，我们计划在本财政年度内通过RNA测序确认Wnt下游基因的表达水平和Wnt途径的激活。此外，根据存在或不存在钙粘蛋白表达的细胞生育能力，细胞迁移能力和细胞侵袭能力，将与上述细胞系进行比较，并将进行比较并检查肝癌细胞的性化。