肝細胞がん多段階発がんにおけるWNTパスウェイ活性化メカニズムの解明

阐明肝细胞癌多步癌变过程中WNT通路激活机制

• 批准号: 21K08807
• 负责人: 緑川 泰
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: National Center of Neurology and Psychiatry
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08807/
• 关键词: 肝細胞癌; WNTパスウェイ; ベータカテニン; E-カドヘリン; 細胞悪性度; 多段階発がん; 次世代シーケンサー

昨年度までに行ったシーケンスによる8種類の肝がん細胞株についてベータカテニンの遺伝子異常については以下の通りである。ベータカテニンmut:HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, HLEベータカテニンWT: Huh7, SH-Hep1CDH1を強制発現させるために現在まで以下の実験を遂行している。すなわちCDH1の転写領域全長（2,807bp）をpCDH-EF1-T2A-Puro（レンチウィルスベクター）にサブクローニングした。さらに上記のベータカテニンmut の各細胞株にトランスフェクションすることによりE-カドヘリンの発現を誘導し、48時間後に免疫染色によりE-カドヘリンの細胞膜への局在でトランスフェクションの効率については判定した。CDH1発現によるベータカテニンの核への移行の影響についても、免疫染色によりトランスフェクション前後の細胞株を比較検討を行い、高い高率でトランスフェクションが行われていることを確認した。CTNNB1 mut過剰発現についてもベータカテニンmutを有する細胞株HepG2よりCTNNB1の全長（3,488bp）をサブクローニングした後、トランスフェクションは上記の方法でベータカテニンWT細胞株に行った。さらにこれらのDNA導入した細胞株についてsiRNAによりCDH1をノックダウンすることによりカテニンの核への移行を確認する予定である。上記で作成した肝がん細胞について、今年度中にRNAシーケンスによりWNT下流遺伝子の発現レベルの 化、WNTパスウェイの活性化を確認する予定である。さらに、上記で作成した細胞株についてそれぞれカドヘリン発現の有無で細胞 殖能、細胞遊走能、細胞浸潤能などを比較し、肝がん細胞の 性化について比較検討する予定である。

根据截至去年的测序结果，8种肝癌细胞系中β-连环蛋白的遗传异常如下。迄今为止，我们已经进行了以下实验来强制表达β-连环蛋白突变：HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5、HLE β-连环蛋白WT：Huh7、SH-Hep1CDH1。即，将CDH1的全长转录区（2,807bp）亚克隆到pCDH-EF1-T2A-Puro（慢病毒载体）中。此外，通过用上述β-连环蛋白突变体转染每个细胞系来诱导E-钙粘蛋白的表达，48小时后，通过免疫染色基于E-钙粘蛋白在细胞膜上的定位来确定转染效率。关于CDH1表达对β-catenin转位至细胞核的影响，我们使用免疫染色比较了转染前后的细胞系，并证实转染发生率很高。关于CTNNB1 mut过表达，从具有β-连环蛋白突变的细胞系HepG2中亚克隆全长CTNNB1（3,488 bp），然后使用上述方法转染到β-连环蛋白WT细胞系中。此外，我们计划通过在已引入这些 DNA 的细胞系中使用 siRNA 敲低 CDH1 来确认连环蛋白易位至细胞核。我们计划在本财年利用上述创建的肝癌细胞，利用RNA测序来确认WNT下游基因的表达水平以及WNT通路的激活。此外，我们计划根据钙粘蛋白表达的存在与否来比较上述创建的细胞系的细胞增殖、迁移和侵袭能力，并对肝癌细胞的性化进行比较研究。