高精度肝細胞アッセイを実現する自立浮遊スフェロイド培養系の開発

开发用于高精度肝细胞检测的独立式浮动球体培养系统

基本信息

批准号：
21J13119
负责人：
露久保淳
金额：
$ 0.96万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-28 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21J13119/
关键词：
自立浮遊ハイドロゲル膜スフェロイドアレイ HepG2 CYP1A2

项目摘要

医薬品候補化合物の安全性を高精度に評価可能な肝細胞アッセイ系の実現を目指して、しなやかなハイドロゲル膜足場を用いた新規スフェロイド培養系の構築を目的とする。市販ポリマー試薬を用いて、hydroxypropyl cellulose(HPC)から成る自立浮遊ハイドロゲル膜の簡便な作製法を開発した。架橋HPCの架橋密度や犠牲層の厚さを調整することにより、柔軟かつ安定した浮遊膜を作製できることが示された。また、光応答性のcoumarinを側鎖に持つpoly (methyl methacrylate)を膜上にコート後、ドットパターンの紫外光を照射することにより、膜上で任意の大きさ及び間隔でHepG2細胞から成るスフェロイドアレイを調製、目的の自立浮遊スフェロイド培養系を構築した。構築した培養系の有用性を確認するために、ハイドロゲル膜については上記浮遊条件と基材に固定された条件、培養細胞についてはスフェロイドアレイ条件と単層条件から成る計4通りの培養系を用意した。ディッシュを左右交互に傾けることで培地の対流を促しつつ培養を行い、培養15日後における細胞のグルコース産生量に対する乳酸産生量の比率(L/G)と、肝特異的な薬物代謝酵素CYP1A2に関するmRNA発現量を測定した。その結果、浮遊膜上では、固定膜上と比較して有意に好気的で、CYP1A2発現量も有意に高かった。さらにスフェロイドアレイ培養系は、単層培養系よりCYP1A2発現量が有意に高いことが確認された。よって、本研究で新規に提案した自立浮遊スフェロイド培養系が４つの培養条件の中で最も高いCYP1A2発現を示し、HepG2の肝特異的機能の亢進に寄与することが実証された。本研究より、動物試験代替法の新たな技術開発に貢献し得る重要な知見を得た。

我们的目标是利用柔性水凝胶膜支架构建新型球体培养系统，以实现能够高精度评估候选药物化合物安全性的肝细胞检测系统。使用市售聚合物试剂，我们开发了一种简单的方法来制造由羟丙基纤维素（HPC）制成的独立式水凝胶膜。结果表明，通过调节交联 HPC 的交联密度和牺牲层的厚度可以创建柔性且稳定的浮膜。此外，通过在侧链上含有光响应香豆素的聚甲基丙烯酸甲酯涂覆膜，并用点状紫外线照射它，可以在膜上形成由任意大小和间距的HepG2细胞组成的球体制备阵列并构建所需的独立式漂浮球体培养系统。为了证实构建的培养系统的有用性，我们测试了总共四种培养系统，包括上述水凝胶膜的浮动条件和固定条件，以及培养细胞的球体阵列条件和单层条件。通过左右交替倾斜培养皿以促进培养基对流进行培养，培养15天后，乳酸产量与葡萄糖产量的比率（L/G）以及与肝脏特异性药物代谢相关的mRNA测定酶CYP1A2的表达水平。结果，漂浮膜的需氧性明显高于固定膜，CYP1A2的表达水平也明显更高。此外，证实球体阵列培养系统中CYP1A2的表达水平显着高于单层培养系统。因此，表明本研究新提出的自立式漂浮球体培养系统在四种培养条件中表现出最高的CYP1A2表达，并有助于增强HepG2的肝脏特异性功能。这项研究产生了重要的知识，有助于开发替代动物试验的新技术。