新規病原体核酸検査に用いる汎用的精度管理標品の迅速な作成を検証に資する研究

有助于验证快速创建用于新型病原体核酸检测的通用质量控制标本的研究

基本信息

批准号：
21K08497
负责人：
石井良和
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Toho University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

PCR検査に代表される病原体核酸検査において、その精度管理は重要な課題である。精度管理すべき検査工程として、核酸抽出から試薬混合調製までの検査前プロセス、DNA増幅(標的がRNAの場合は逆転写工程を含む) から検出までの検査プロセス、結果解釈から報告までの検査後プロセスがある。検査前プロセスから検査後プロセスまでの全工程を精度管理するには、標的核酸が対象病原体と同等の膜などに封入された状態のフルプロセスコントロール試料が必要である。本研究では、SARS-CoV-2のPCR検査をモデルとして、任意のRNA塩基配列を組み込んでパーティクルに封入できる市販の組換えレンチウイルス作成キット (タカラバイオ) を用いたフルプロセスコントロール試料作製方法を検証する。この方法は、新たに流行する病原体の病原体核酸検査の迅速なフルプロセスコントロール試料作製への応用が期待される。フルプロセスコントロールに組み込む標的は、国立感染症研究所および米国Center for Disease Control and Preventionが公表するreverse-transcription (RT)-PCRの標的に加え、本邦で利用可能なRT-qPCR検査キットの標的とされている、Orf1b, S, およびE遺伝子の一部を直列につなぎ合わせた配列を、人工遺伝子合成サービスに委託して入手した。これをレンチウイルスベクタープラスミド pLVSINに挿入し、Lentiviral High Titer Packaging MixとともにLenti-X 293T細胞にコトランスフェクションすることにより、任意の配列をRNAゲノムに有する組換えレンチウイルスを取得した。今後、組換えレンチウイルスの安定性を確認した後、外部精度管理における精度管理試料としての妥当性を確認する。

在病原体核酸测试（例如PCR测试）中，准确性控制是一个重要问题。需要控制的测试步骤包括预测试过程，从核酸提取到试剂混合制剂，测试过程，从DNA扩增（包括目标是RNA（如果目标是RNA））到检测到检测后的测试，从解释结果到报告。为了准确控制从测试前过程到测试后过程的所有步骤，需要一个完整的过程控制样品，其靶核酸封装在等于靶病原体的膜中。在这项研究中，我们将研究一种使用市售重组慢病毒创造试剂盒（Takara Bio）准备完整的受控样品的方法，该样品可以结合任何RNA碱基序列并封装颗粒。预计该方法将应用于新流行的病原体的病原体核酸测试的快速，完整的受控样品制备。除了由国家传染病研究所和美国疾病控制与预防中心发表的逆转录（RT）-PCR目标外，还通过将人工基因合成服务托运到人造基因合成服务中获得了完整过程控制的目标，以及一系列由ORF1B，s和E基因通过RT-QPCR测试销售的序列。将其插入慢病毒载体质粒pLVSIN中，并与慢病毒高滴度包装混合物共转染到Lenti-X 293T细胞中，以获得RNA基因组中携带任何序列的重组慢病毒。将来，在确认重组慢病毒的稳定性之后，将确认它被证实为用于控制外部准确性准确性的样本。