Investigation for clinical application of phospholipase D4 in autoimmune diseases

磷脂酶D4在自身免疫性疾病中的临床应用探讨

• 批准号: 21K08475
• 负责人: 秋月 修治
• 金额: $ 2.25万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K08475/
• 关键词: 自己免疫疾患; ホスホリパーゼD4; トール様受容体; 全身性自己免疫疾患

A. 血漿中遊離型PLD4の定量ヒト血漿サンプル中の遊離型PLD4を定量し、自己免疫疾患患者と健常者を比較し、臨床的バイオマーカーとなる可能性を追求した。抗ヒトPLD4抗体でELISA系を樹立し、大腸菌由来リコンビナントPLD4をサンプルとした測定系では定量性を持って計測された。他方でヒト血漿検体では段階希釈法で定量性が確認されなかった。ELISA系が適正に働かない原因とし、① 夾雑する他の血漿由来タンパクによる反応阻害、② 使用した抗ヒトPLD4抗体が哺乳類細胞由来PLD4を認識しない可能性を挙げた。まずは後者の抗原抗体反応の適正性を確認するため、PLD4を遺伝子導入したHEK293Tのライセートを用いウェスタンブロットを行った結果、使用した抗ヒトPLD4抗体と哺乳動物細胞発現のPLD4に反応性が確認された。現在は、上記ELISA法の陽性対照とするため、遊離型PLD4を模した分泌型免疫グロブリン定常領域融合PLD4発現ベクターをHEK293Tに遺伝子導入し、タンパク発現を確認した状況である。B. 患者末梢血単核球（PBMC）におけるPLD4発現プロファイルの計測ヒトPBMCにおいて、PLD4トランスクリプトはB細胞、単球に選択的に発現するが、健常者と疾患患者の間で差異は認めなかった（2022年度報告）。他方、樹状細胞（DCs）をconventional DCsと形質細胞様樹状細胞（pDCs）を亜分画した結果、pDCsはB細胞、単球に比してPLD4を多く発現することが判明した。pDCs、B細胞、単球は共通してトール様受容体（TLR）7、9を高発現し、一本鎖DNAやRNAを認識し、免疫応答を駆動する。現在は単離したヒトB細胞、単球、pDCsをTLR7、TLR9リガンド存在下で培養し、PLD4トランスクリプト発現を定量する計画である。

答：我们在血浆中的定量人血浆样本中量化了免费的-PLD4，比较了自身免疫性疾病和健康人的患者，并追求成为临床生物标志物的可能性。用抗PLD4抗体建立ELISA系统，并使用大肠杆菌的重组PLD4作为样品在测量系统中用数量进行测量。另一方面，在人血浆标本中的水平稀释方法中未确认定量。 ELISA系统无法正常工作，并指出（1）其他衍生得出的血浆蛋白的反应抑制作用，以及（2）所使用的抗HIT PLD4抗体可能无法识别哺乳动物细胞衍生的PLD4。首先，为了确认后者的抗原抗体反应的适当性，使用HEK293T许可的HEK293T的Western印迹 - 染色的HEK293T许可证，并通过抗HIT PLD4抗体和哺乳动物细胞表达的PLD4确认了反应性。目前，为了与上述ELISA方法的阳性对比，分泌 - 型免疫球蛋白恒定融合pLD4表达载体模仿了自由-Type PLD4，已引入HEK293T，并确认了蛋白质表达。 B. PLD4表达曲线在外周血核细胞（PBMC）中测量了PLD4转录本在B细胞和单个Bulk中选择性表达，但健康和疾病患者之间没有差异（2022年报告）。另一方面，发现与B细胞和单核细胞相比，PDC会表达更多的PLD4，这是由于输送DCS（DC）和传输样树细胞（PDC）的减法而表达的。 PDC，B细胞和单个灯泡通常表达类似收费的受体（TLR）7和9，识别单个链的DNA和RNA，并驱动免疫反应。目前，分离的人类B细胞，单核细胞和PDC在TLR7和TLR9配体的存在中培养，我们计划量化PLD4转录本的表达。