Mechanisms of CHI3L1-mediated p53 suppression in the early stage of colon cancer

CHI3L1介导的结肠癌早期p53抑制机制

基本信息

批准号：
21K07996
负责人：
溝口恵美子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

炎症性腸疾患における慢性炎症時に、腸管上皮細胞が異形成から早期癌を起こす過程で、酵素活性を持たないがキチン質に結合能を有するキチナーゼ３様タンパク１型 (CHI3L1)が深く関与していることが知られている。CHI3L1には、144～174番目のアミノ酸に核内局在にかかわると推測されるシークエンスが存在し、最尾部(170～174番目)に推測上の細胞周期にかかわる蛋白であるサイクリンの結合部位が存在し、その近傍に２ヶ所のサイクリンリン依存性キナーゼ（CDK)のリン酸化部位が存在していることも確認している。我々は、CRISPR/Cas9法を使って、ヒト大腸癌細胞株であるSW480細胞のCHI3L1蛋白内の170～174番目のアミノ酸を欠失した安定発現細胞株を作成して、この細胞をknockout (KO)株と命名した。さらに、このKO細胞に全長のヒトCHI3L1 cDNAを組み込んだpEGFP N1ベクターを導入した安定発現株（W2D11株）と同一ベクターのみを導入したmock安定発現株（M3C6株）を作成した。我々は、上記３細胞株と野生株（WT株）の４種類を合計30匹のbalb/cAJcl-nuヌードマウスの後背部に接種したが、SW480細胞が生着したのは約15％のW2D11株のみであり、腹水由来のSW480細胞がこのような腫瘍の生着実験には向かないことが分かった。前年度の実験で、CHI3L1の核内移行にかかわると考えられる２種類の分子である、蛋白X, 蛋白Yを同定したが、pCDNA3.1(+)ベクター（FLAG-tag）に全長のヒト蛋白Xまたは蛋白Y ｃDNAを挿入して強制発現させたところ免疫染色およびIP western blot法の両方でCHI3L1/蛋白X, CHI3L1/蛋白Y の結合を確認できた。現在、Cell Signaling (Danvers, MA)のマウス抗ヒトp53モノクローナル抗体を免疫染色に使用しているが、SW480細胞およびヒト大腸癌組織の両方でp53発現が弱くしか認められず、今後は他社の抗p53抗体に変更して実験を進める予定である。

在炎症性肠道疾病的慢性炎症的情况下，在导致早期癌症的过程中，没有酶活性，但具有结合能力知道在那里。 CHI3L1的序列被认为是在第144至174氨基酸中与核本地人有关的序列，而细胞周期蛋白的结合位点是估计细胞周期中假定与细胞周期的蛋白质（170-174th）。它也存在，并且还证实了两个依赖性依赖性激酶（CDK）具有磷酸化位点。我们使用CRISPR/CAS9方法来创建稳定的表达细胞库存，在SW480细胞的Chi3L1蛋白中损失了170至174氨基酸，这些细胞是人类结直肠癌细胞库存，敲除（KO（KO））被称为库存。此外，创建了一种模拟稳定表达（M3C6），它仅引入了与稳定表达式（W2D11股票）与PEGFP N1矢量融合到KO细胞中的稳定表达式（W2D11股票）。我们已经在上述三个单元股份和野生股票（WT股票）的背面接种了总共30个BALB/CAJCL -NU小鼠的背面，发现它仅用于股票，而腹水衍生的SW480细胞是不适合这种肿瘤。蛋白质X和蛋白质Y是两种类型的分子，这些分子被认为与上一年有关CHI3L1的核转变，但已鉴定出来，但是PCNA3.1（+）矢量的总长度（flag-tag））。当前，小鼠抗热门的p53单克隆抗体（MA）用于免疫染色，但是SW480细胞和人类结直肠癌组织都只有p53的表达较弱，我们计划将来变为P53。抗体并进行实验。