Mechanisms of CHI3L1-mediated p53 suppression in the early stage of colon cancer

CHI3L1介导的结肠癌早期p53抑制机制

基本信息

批准号：
21K07996
负责人：
溝口恵美子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

炎症性腸疾患における慢性炎症時に、腸管上皮細胞が異形成から早期癌を起こす過程で、酵素活性を持たないがキチン質に結合能を有するキチナーゼ３様タンパク１型 (CHI3L1)が深く関与していることが知られている。CHI3L1には、144～174番目のアミノ酸に核内局在にかかわると推測されるシークエンスが存在し、最尾部(170～174番目)に推測上の細胞周期にかかわる蛋白であるサイクリンの結合部位が存在し、その近傍に２ヶ所のサイクリンリン依存性キナーゼ（CDK)のリン酸化部位が存在していることも確認している。我々は、CRISPR/Cas9法を使って、ヒト大腸癌細胞株であるSW480細胞のCHI3L1蛋白内の170～174番目のアミノ酸を欠失した安定発現細胞株を作成して、この細胞をknockout (KO)株と命名した。さらに、このKO細胞に全長のヒトCHI3L1 cDNAを組み込んだpEGFP N1ベクターを導入した安定発現株（W2D11株）と同一ベクターのみを導入したmock安定発現株（M3C6株）を作成した。我々は、上記３細胞株と野生株（WT株）の４種類を合計30匹のbalb/cAJcl-nuヌードマウスの後背部に接種したが、SW480細胞が生着したのは約15％のW2D11株のみであり、腹水由来のSW480細胞がこのような腫瘍の生着実験には向かないことが分かった。前年度の実験で、CHI3L1の核内移行にかかわると考えられる２種類の分子である、蛋白X, 蛋白Yを同定したが、pCDNA3.1(+)ベクター（FLAG-tag）に全長のヒト蛋白Xまたは蛋白Y ｃDNAを挿入して強制発現させたところ免疫染色およびIP western blot法の両方でCHI3L1/蛋白X, CHI3L1/蛋白Y の結合を確認できた。現在、Cell Signaling (Danvers, MA)のマウス抗ヒトp53モノクローナル抗体を免疫染色に使用しているが、SW480細胞およびヒト大腸癌組織の両方でp53発現が弱くしか認められず、今後は他社の抗p53抗体に変更して実験を進める予定である。

在炎症性肠病中的慢性炎症过程中，肠上皮细胞从发育异常，几宿酶3类蛋白1型（CHI3L1）中发展出早期癌症，该蛋白质没有酶活性，但具有结合基思素的能力，已知与偶然涉及。在CHI3L1中，估计有一个序列参与氨基酸144至174的核定位，也已经证实，Cyclin的结合位点（一种涉及细胞周期的蛋白质）在尾部末端（170至174）存在（170至174），并且存在两个磷酸化的位点，以构成环蛋白磷脂的依赖性KINSES（CDESS）依赖性的Kinasase（CDKS）。我们使用CRISPR/CAS9方法创建了稳定的表达细胞系，该细胞系在SW480细胞的CHI3L1蛋白（人类结肠癌细胞系）中删除了170-174的氨基酸，并将该细胞命名为基因敲除（KO）菌株。此外，还产生了稳定的表达应变（M3C6菌株），其中将掺入全长人CHI3L1 cDNA的PEGFP N1矢量引入了这些KO细胞中（W2D11菌株），并引入了同一载体。我们接种了上述三种细胞系的四种类型，野生菌株（WT菌株）分为总共30个BALB/cajcl-nu裸鼠的背面，但只有大约15％的W2D11菌株的菌株刻有15％，发现来自腹水的SW480细胞不适用于此类肿瘤植入实验。在上一年的实验中，蛋白质X和蛋白质Y，被认为参与CHI3L1的核易位的两个分子。 However, when full-length human protein X or protein Y cDNA was inserted into the pCDNA3.1(+) vector (FLAG-tag), binding of CHI3L1/protein X and CHI3L1/protein Y was confirmed by inserting the full-length human protein X or protein Y cDNA into the pCDNA3.1(+) vector (FLAG-tag), binding of CHI3L1/protein X and通过免疫染色和IP Western印迹证实了CHI3L1/蛋白质Y。目前，细胞信号（MA）小鼠抗人p53单克隆抗体用于免疫染色，但在SW480细胞和人类结肠癌组织中，p53表达仅较弱，因此我们计划将另一家公司的抗P53抗体转变为抗P53抗体。