萎縮性胃炎オルガノイドからの腸上皮化生、腸型胃がん発がんモデルの構築

萎缩性胃炎类器官肠化生及肠型胃癌癌变模型的构建

基本信息

批准号：
21K07915
负责人：
有山寛
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでの臨床検体での解析から健常部ではLGR5陽性細胞は検出困難であったが、萎縮性胃炎では有意にLGR5発現細胞が増加しており、萎縮性胃炎から樹立したオルガノイドも多くがLGR5陽性であった。オルガノイド培養系においてWnt3a、Nogginを添加しない場合はオルガノイド形成が見られず、オルガノイド形成及びLGR5陽性細胞の維持にはWNTシグナルが必須であった。臨床検体においては腺底部にWNT3aを発現する細胞が認められ、現在免疫染色を行い、これらWnt3a発現細胞の同定を行っている。LATS2 KOによる腸上皮化生のメカニズムとして、LATS2ノックアウト後に定量的PCRによりID4の発現亢進を認め、BMPシグナルの関与が示唆された。LATS2またはRUNX3のみのノックアウトではマウスにおける造腫瘍性を確認できなかったが、これらのノックアウトに加えてTP53あるいはSMAD4をノックアウトすることで、マウスにおける造腫瘍性が確認できた。さらにTP53と比較して、SMAD4 double knock outオルガノイドを移植した場合では、腫瘍内に浸潤するCD68陽性マクロファージの有意な増加とCCL2の mRNA発現が亢進しており、腸型胃がんにおける炎症性の微小環境構築にSMAD4が関与する可能性が示唆された。コヒーシン構成分子の異常による染色体不安定性の誘導を目的に、胃がんAGS細胞株を用いて予備実験を行った。STAG1遺伝子をCRISPR-Cas9システムで用いてノックアウトし、染色体不安定性をmFISHで解析を行ったが、STAG1遺伝子のノックアウトによる染色体異常の増加は認めなかった。

先前对临床标本的分析表明，在健康组织中很难检测到LGR5阳性细胞，但在萎缩性胃炎中表达LGR5的细胞显着增加，并且许多从萎缩性胃炎建立的类器官也是LGR5阳性的。在类器官培养系统中，当不添加Wnt3a和Noggin时，没有观察到类器官形成，表明WNT信号对于类器官形成和LGR5阳性细胞的维持至关重要。在临床标本中，在腺体基部观察到表达WNT3a的细胞，我们目前正在进行免疫染色来鉴定这些表达Wnt3a的细胞。至于LATS2 KO引起肠化生的机制，通过定量PCR观察到LATS2敲除后ID4表达增加，表明BMP信号参与其中。虽然无法通过仅敲除LATS2或RUNX3来确认小鼠的致瘤性，但除了这些敲除以外还可以通过敲除TP53或SMAD4来确认小鼠的致瘤性。此外，与TP53相比，当移植SMAD4双敲除类器官时，浸润肿瘤的CD68阳性巨噬细胞显着增加，CCL2 mRNA表达增强，表明肠型胃癌的炎症微环境SMAD4 可能参与组装。我们使用胃癌 AGS 细胞系进行了初步实验，目的是诱导由于粘连蛋白组成分子异常而导致的染色体不稳定。使用CRISPR-Cas9系统敲除STAG1基因，并使用mFISH分析染色体不稳定性，但没有观察到由于STAG1基因敲除而导致染色体异常增加。