Analysis of genomic instability caused by environmental stress

环境胁迫引起的基因组不稳定性分析

基本信息

批准号：
21H04761
负责人：
小林武彦
金额：
$ 26.37万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-05 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H04761/
关键词：
環境ストレスゲノムの不安定性出芽酵母リボソームRNA遺伝子ヒストンの脱アセチル化酵素ゲノム安定性クロマチン免疫沈降法ヒストン脱アセチル化酵素非コードプロモーター酸性培地ゲノムの安定性酸性度寿命環境適応

项目摘要

これまでの研究で、酸性培地で酵母を培養するとゲノムの不安定領域であるリボソームRNA遺伝子（rDNA）が、安定化することを見出している。rDNAの不安定性に影響を与える要因として、１）DNA複製阻害配列での複製の停止、およびその結果生じるDNAの切断、２）非コードプロモーター（E-pro）の転写による姉妹染色分体の乖離、の２つがあげられる。これまでに、予備的ではあるが、酸性条件下ではDNA複製阻害配列での停止頻度に変化はないこと、非コードプロモーター（E-pro）の転写産物量が低下していることを見出していた。そこでデータベースから検出した転写活性に関わるヒストン修飾関連の遺伝子（59個）を選び出し、それらをノックアウトして、酸性条件下でのrDNAの安定性に与える影響を調べた。その結果、いくつかの候補遺伝子を得ることに成功し、中でも１番顕著な、つまり酸性条件下でもrDNAの安定化がみられなくなったrpd3欠損株の解析を中心に行なっている。Rpd3はヒストンの脱アセチル化酵素（HDAC）で、転写の抑制作用をもつことが知られている。作業仮説としてはRpd3が酸性条件下で、E-proの転写を抑制し、rDNAを安定化していると考えられる。当該年度はまず、酸性条件下ではDNA複製阻害配列での停止頻度に変化がないこと、非コードプロモーター（E-pro）の転写産物量が低下していることを、それぞれ二次元アガロース電気泳動法およびノーザン解析で確認した。また、酸性度に依存したRpd3のrDNAへの結合および局在の変化を、クロマチン免疫沈降法を用いて調べた。コロナ禍で研究に用いる資材、特にPCR関連の試薬の入手が困難となるなど、想定外のトラブルが生じ、繰越の上、ようやくクロマチン免疫沈降法を実施することができた。今のところはまだデータが安定しておらず、条件検討を行いながら引き続き解析を継続している。

先前的研究发现，在酸性介质中培养酵母可以稳定核糖体 RNA 基因 (rDNA)，这是基因组中的一个不稳定区域。影响 rDNA 不稳定的因素包括 1) DNA 复制抑制序列处的复制终止以及由此产生的 DNA 断裂，以及 2) 由于非编码启动子 (E-pro) 的转录导致的姐妹染色单体的分离。有两个例子：到目前为止，我们初步发现，在酸性条件下，DNA 复制抑制序列的终止频率没有变化，并且非编码启动子 (E-pro) 的转录物数量减少。因此，我们从数据库中筛选出59个与组蛋白修饰相关、参与转录活性的基因，将其敲除，并研究其在酸性条件下对rDNA稳定性的影响。结果，我们成功获得了几个候选基因，目前我们正在重点分析最突出的一个，即rpd3缺陷菌株，该菌株即使在酸性条件下也没有表现出rDNA的稳定性。 Rpd3 是一种组蛋白脱乙酰酶 (HDAC)，已知可以抑制转录。一个可行的假设是，Rpd3 在酸性条件下抑制 E-pro 转录并稳定 rDNA。本财年，我们首次利用二维琼脂糖电泳证实酸性条件下DNA复制抑制序列的终止频率没有变化，并且非编码启动子（E-pro）的转录物量也没有变化。减少并由北方分析证实。我们还使用染色质免疫沉淀研究了 Rpd3 与 rDNA 结合和定位的酸度依赖性变化。由于冠状病毒的流行，出现了意想不到的问题，比如研究材料特别是PCR相关试剂的获取困难，我们在承接后终于能够进行染色质免疫沉淀方法。目前数据还不稳定，我们正在结合条件继续分析。