ビタミンB6依存性てんかんの早期診断体制構築に向けたバイオマーカーの測定と探索

建立维生素B6依赖性癫痫早期诊断体系的生物标志物测定与探索

基本信息

批准号：
21K07798
负责人：
秋山倫之
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ビタミンB6（VB6）依存性てんかんのバイオマーカー測定系の開発に関しては、分離・定量に課題が生じていたピリドキサミンに対し、塩基性物質の保持が可能なカラムを種々入手して検討したところ、十分な保持が得られるカラムが見つかった。その中から、ピリドキサミンと4-ピリドキシン酸両者が十分保持されるカラムを選び、今後の測定系開発に用いることにした。当初予定していた蛍光検出による測定法から質量分析による測定法への変更を行うことにしたため、蛍光を発さない他の物質の同時検出が可能になり、ALDH7A1欠損症およびPNPO欠損症の診断バイオマーカーの同時検出の条件がある程度定まった。また、内部標準（安定同位体）で市販されていない化合物があったが、他の化合物の安定同位体からの合成を試み、目的の化合物を得ることができた。現在、血清検体での前処理条件を検討中であり、今後は測定系のバリデーションに取り掛かる。その後、尿・髄液検体での測定方法の検討に進む予定である。遺伝子解析については、サンガー法、リアルタイムPCR、全エクソーム解析、全ゲノム解析を用い、既報の原因遺伝子に関しては診断可能な状態になっている。今後、臨床的にビタミンB6で発作が完全抑制された患者数名に対し、解析を予定している。酵素活性測定についてはALDH7A1についての検討を進め、培養尿由来細胞で酵素活性が測定できることが判明した。現在、測定条件の最適化と感度向上を目指している。また、ADLH7A1欠損症患者の尿検体を収集し、尿由来細胞の培養を進めている。

关于维生素 B6 (VB6) 依赖性癫痫生物标志物测定系统的开发，我们获得并研究了各种可以保留分离和定量方面存在问题的吡哆胺碱性物质的色谱柱，发现 A 色谱柱就足够了。发现良好的保留。其中，我们选择了一种能够充分保留吡哆胺和4-吡哆酸的色谱柱，并决定将其用于未来测量系统的开发。由于我们决定将原来计划的使用荧光检测的测量方法更改为使用质谱的测量方法，因此可以同时检测其他不发出荧光的物质，这成为诊断 ALDH7A1 缺乏症和 PNPO 缺乏症的条件。生物标志物的同步检测已在一定程度上得到建立。此外，还有一种化合物无法作为内标（稳定同位素）市售，但通过尝试从另一种化合物的稳定同位素合成它，我们能够获得所需的化合物。我们目前正在考虑血清样本的预处理条件，并将在未来开始验证测量系统。之后，我们计划继续研究使用尿液和脑脊液样本的测量方法。遗传分析采用桑格法、实时PCR、全外显子组分析和全基因组分析，现在可以诊断以前报道的致病基因。未来，我们计划分析几位临床上使用维生素 B6 完全抑制癫痫发作的患者。关于酶活性测量，我们研究了 ALDH7A1，发现可以在培养的尿液来源的细胞中测量酶活性。目前，我们的目标是优化测量条件并提高灵敏度。我们还收集 ADLH7A1 缺陷患者的尿液样本并培养尿液来源的细胞。