Functional analysis of bacterial cellulose synthesis to overcome biofilm infections

细菌纤维素合成克服生物膜感染的功能分析

• 批准号: 21K07355
• 负责人: 菅原 佳奈子
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Nihon institute of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07355/
• 关键词: セルロース合成酵素; バイオフィルム; 膜タンパク質; 複合体タンパク質; バクテリアセルロース

本研究課題では、感染症の難治化の要因であるバイオフィルムの合成機序を明らかにするため、バイオフィルムの主成分であるバクテリアセルロース（BC）の合成機構の解明に取り組んでいる。BCは細菌の細胞膜上に存在するセルロース合成酵素複合体（TC）によって合成されている。本研究ではBC合成機構の中でも特に、（１）合成されたセルロース鎖を菌体外へ排出すると推測されるBcsCサブユニットの立体構造（２）内膜のBcsABによって合成されたセルロース鎖がどのように外膜のBcsCに受け渡され、菌体外へ導かれるのか、の2点に注目して研究を進めている。これまでの進捗として、まず上記（１）について、BcsCの単離精製のため、酢酸菌ゲノム上のTCを構成するBcsAおよびBcsCサブユニットにタンパク質精製用のアフィニティタグを挿入した。次に（２）について、内膜のBcsABと外膜のBcsCとの会合状態の解明に取り組んだ。BcsABとBcsCとの会合については、直接の結合と、別の分子を介した結合のいずれであるか分かっていない。TCにはBCの合成や輸送においてメインに機能するサブユニットの他に、機能不明のアクセサリーサブユニットが存在しており、これらがBcsABとBcsCの結合に関与する可能性が高いと考えた。そこでアクセサリーサブユニットであるBcsD、Ccp、CMCaseの3つのタンパク質を組換え発現し、これらのタンパク質同士が会合して複合体を形成するかどうか確認した。ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子質量の測定結果から、BcsDとCcpの組み合わせで分子質量の大きい複合体の形成が示された。

在本研究项目中，我们致力于阐明生物膜的主要成分——细菌纤维素（BC）的合成机制，以阐明作为传染病难治性因素的生物膜的合成机制。 BC 由细菌细胞膜上的纤维素合酶复合物 (TC) 合成。在本研究中，我们重点关注BC合成机制，特别是（1）BcsC亚基的三维结构，假设它从细菌体内排出合成的纤维素链，以及（2）纤维素的结构我们的研究主要集中在两点：是否传递到外膜中的BcsC并被引导出细菌细胞。就目前取得的进展而言，首先，关于上述(1)，为了分离和纯化BcsC，我们将用于蛋白质纯化的亲和标签插入到构成醋杆菌基因组TC的BcsA和BcsC亚基中。接下来，关于(2)，我们致力于阐明内膜中的BcsAB和外膜中的BcsC之间的结合状态。目前尚不清楚 BcsAB 和 BcsC 是直接结合还是通过另一个分子结合。除了主要在BC合成和运输中发挥作用的亚基外，TC还含有功能未知的辅助亚基，我们假设这些亚基很可能参与BcsAB和BcsC的结合。因此，我们重组表达了三个辅助亚基蛋白BcsD、Ccp和CMCase，并确认这些蛋白是否彼此缔合形成复合物。凝胶过滤色谱测定分子量结果表明，BcsD和Ccp结合形成了大分子量的复合物。