BRCA1複合体の中心体制御機構の解析による組織特異的発がん機序の解明

通过分析BRCA1复合物的中心体控制机制阐明组织特异性致癌机制

基本信息

批准号：
21K07143
负责人：
吉野優樹
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07143/
关键词：
中心体中心小体 BRCA1 RACK1 乳がん翻訳後修飾局在制御

项目摘要

BRCA1複合体による中心体複製制御機構を明らかにするため、本年度はBRCA1複合体構成因子が中心小体複製のどのステップに必要なのかを解析した。BRCA1複合体構成因子であり、中心体複製に必要であることが明らかになっているRACK1をRNAiでノックダウンし、中心小体複製の各段階が進行しうるかを調べた。中心小体複製のマーカーとして、娘中心小体複製の足場として最初期に母中心小体に集族するCEP192およびCEP152、CEP152依存性に活性化したPLK4によってリン酸化され、娘中心小体原基を形成するSTILおよびNEDD1を用いて解析を行った。その結果、RACK1をノックダウンするとSTIL、NEDD1の集族が抑制された。このことから、RACK1が娘中心小体原基の形成ステップで必要であることが示唆された。また、RACK1は複数の残基でリン酸化を受けることが知られている。中心体においてリン酸化されていることが示唆されているセリン残基を変異させ、内在性RACK1をノックダウンした細胞に発現させたところ、STILの集族障害をレスキューできなかった。さらに、同セリン残基のリン酸化ペプチドに対する特異抗体を作成し、免疫染色によってリン酸化RACK1の局在を観察したところ、リン酸化RACK1が中心体に局在し、その局在量は細胞周期によって変動することが明らかになった。これらから、RACK1が中心体制御キナーゼによってリン酸化されることが、娘中心小体原基形成に必要であることが示唆された。さらに、種々の細胞株を用いて解析したところ、RACK1をノックダウンすると乳がん細胞株ではSTILの集族が抑制されるが、乳がん以外の細胞株では抑制されず、娘中心小体原基形成のRACK1依存性は組織特異的であることが示唆された。

为了阐明BRCA1复合体控制中心粒复制的机制，今年我们分析了中心粒复制的哪些步骤需要BRCA1复合体成分。我们使用RNAi敲低RACK1（BRCA1复合物的组成部分，已知是中心体复制所必需的），以检查中心体复制的每一步是否可以进行。作为中心粒复制的标志物，CEP192和CEP152在最早阶段组装成母体中心粒，作为子体中心粒复制的支架，并被CEP152依赖性激活的PLK4磷酸化，从而促进子体中心粒原基的形成。哪种形式。结果，RACK1 的敲低抑制了 STIL 和 NEDD1 的组装。这表明 RACK1 是子中心粒原基形成步骤所必需的。此外，已知 RACK1 在多个残基处发生磷酸化。当我们突变丝氨酸残基（被认为在中心体中被磷酸化）并在内源性 RACK1 被敲低的细胞中表达时，我们无法挽救 STIL 的组装障碍。此外，当我们针对相同丝氨酸残基的磷酸化肽制备特异性抗体并通过免疫染色观察磷酸化RACK1的定位时，我们发现磷酸化RACK1定位于中心体，并且定位量根据细胞周期而变化。很明显，情况正在发生变化。这些结果表明，中心体调节激酶对 RACK1 的磷酸化是子代中心粒原基形成所必需的。此外，使用各种细胞系的分析表明，RACK1 的敲除抑制了乳腺癌细胞系中的 STIL 组装，但在非乳腺癌细胞系中则不然，从而导致子代中心粒原基形成受到抑制。这些结果表明 RACK1 依赖性是组织特异性的。。