転写時間動態解析とCRISPRによる生体内でのFoxp3発現制御メカニズムの解明

使用转录时间动力学分析和 CRISPR 阐明体内 Foxp3 表达控制机制

基本信息

批准号：
21K07082
负责人：
小野昌弘
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K07082/
关键词：
T細胞免疫学転写因子 T細胞分化制御性T細胞時間動態 CRISPR

项目摘要

制御性T細胞(Treg)は転写因子Foxp3のはたらきにより免疫反応を抑制する活性をもつ.しかしTregが生体内でどのようなタイミングで抑制活性を発揮するのか、その動的な分子メカニズムは何かについては概ね不明である.このため申請者は，蛍光Timerタンパクをレポーター遺伝子として用いて生体内での転写の時間動態を1細胞レベルで解析する技術Tockyを開発し，生体内で免疫反応中のT細胞におけるFoxp3転写動態の研究を進めてきた.本研究では，Foxp3の遺伝子制御領域によるFoxp3転写時間動態の制御メカニズムの解明を目指す.特に，Tregが抗原を認識すると，Treg内のFoxp3タンパクがFoxp3遺伝子制御領域に結合して転写を活性化(=自己転写制御ループを作動)させてTregの抑制活性を誘導するという仮説をTockyおよび分子生物学的実験により検討，新規メカニズム解明を目指している。この目的の下、Foxp3-TockyマウスのCNS2配列をCRISPR編集により欠損させたマウス(Foxp3-TockyDCNS2)を使用して，抗原によるT細胞免疫誘導モデル(接触性皮膚炎およびペプチド免疫)を解析し，生体内で免疫反応中にTregがどのようにして抑制活性を発揮する転写プログラムを成立させるかを解析している。特に，Tregが抗原刺激や炎症により活性化してエフェクターTregとなる際のFoxp3転写時間動態に焦点を当て，CNS2配列欠損がFoxp3転写時間動態・エフェクターTregの表現型・機能に与える影響を解明することを目指す。これまでに、定常状態ならびに分化中のFoxp3動態ならびに抗原刺激モデルを使った抗原に反応性のFoxp3の制御を解析してきた。

调节性T细胞（TREG）具有通过转录因子FOXP3的功能抑制免疫反应的活性。但是，通常未知Treg如何在体内施加其抑制活性以及它们的动态分子机制是什么。因此，申请人开发了Tocky，该技术使用荧光定时蛋白作为报告基因来分析一个单细胞水平的体内转录的时间动态，而在体内免疫反应的T细胞中，T细胞中的FO。我们一直在研究XP3转录动力学。在这项研究中，我们旨在阐明FOXP3转录时间动力学受Foxp3基因调节区域调节的机制。特别是，我们正在考虑以下假设：当Treg识别抗原时，Treg中的FOXP3蛋白与Foxp3基因调节区域结合，激活转录（=激活自我转录控制环），并使用Tocky和Mocular生物学实验诱导Treg的抑制作用，并旨在阐明新型机制。出于这个目的，分析了用CRISPR编辑（FOXP3-TOCKYDCNS2）删除的Foxp3-Tocky小鼠的CNS2序列的小鼠，以分析抗原诱导的T细胞免疫反应的模型（接触性皮炎和肽免疫），以及如何在不受影化的反应中建立转录程序，从而在不限制的反应中就可以在不限制的情况下实现。特别是，当Treg被抗原刺激或炎症激活以成为效应的Treg时，我们将重点关注FOXP3转录时间动力学，并旨在阐明CNS2序列缺乏对FOXP3转录时间动态的表型和功能的影响。到目前为止，我们已经使用抗原刺激模型分析了稳态和分化FOXP3动力学以及抗原反应性FOXP3的调节。